elisa测定的可能发生的问题

elisa测定的可能发生的问题

临床酶联合免疫吸附试验（elisa）的测定通常采用微孔板为固相的测量模型。测量和非常简单。通常包括样品的收集和储存、样品的制备、样品的添加、样品的加热、板材的清洗、颜色的显示、结果评估、结果报告和解释。操作不当将影响测量结果。在测量过程中可能出现的主要问题如下。1临床样品的收集和保存1.1血清标本的收集除常规的注意事项外,在采集标本时还应该注意有些药物对测定结果的影响,在收集时要掌握好时间,如激素和治疗药物测定的血清标本,再如治疗药物的检测,应根据药代动力学选服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗体和抗原、肿瘤标志物和特种蛋白等检测的血清标本的收集则没有时间方面的影响。1.2影响测量结果的取样因素患者标本中,有可能会含有干扰酶免疫测定导致假阳性和假阴性结果的干扰因素,一般可分为两类,既内源性和外源性。1.2.1elisa检测固相和酶标二抗的作用机理一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体。在类风湿患者、及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF),RF一般为IgM型亦有IgG和IgA型,RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点,因为在ELISA测定中,其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合,从而出现假阳性结果。在固相酶免疫测定中,来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面,固相抗体和酶标二抗可因为其吸附及结合过程中,抗体分子发生变构,使Fc段的补体C1q结合点暴露出来,使C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。另一方面,固相抗体也会因为活化补体的结合,封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等,能与其相应靶抗原结合形成复合物,在ELISA方法中可干扰相应抗原抗体的测定。溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。可在包被的IgG和酶标的IgG间形成桥接,导致假阳性。1.2.2标本的采集及保存包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。标本要避免严重溶血,血红蛋白中含有血红素基团,有类似过氧化物的活性。因此,在以辣根过氧化物酶(HRP)为标记酶的ELISA测定中容易吸附于固相,从而与后面加入的HRP底物反应显色。标本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染,一则细菌的生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会用对相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。标本采集后要尽早检测,在2~8℃下保存时间过长,IgG可聚合成多聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。血清标本如是以无菌操作分离可在2~8℃下保存1周,如为有菌操作,建议冷冻保存。纤维蛋白原影响结果假阳性,是因为标本凝固不全造成的,在收集管中如无促凝剂和抗凝剂,血液通常在半小时后开始凝固,18~24h完全凝固。日常检验中,常在血液还未开始凝固时即离心分离血清,造成分离血清中含有大量的纤维蛋白原,加入微板在检测过程中仍可形成可见的纤维蛋白块,造成结果假阳性。2假阴性的检测在临床实验室,对试剂的准备一般不太注意,通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用,而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题,其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此,在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是,将试剂盒先从冰箱中拿出来,在室温下放置20~30min以上后,再进行测定,使试剂盒在使用前与室温平衡,以满足后面的检验操作不至于出现误差。3加样的操作在使用加样器进行加样和加样本时,一定要注意加样的速度,保证加样的准确,要避免加在孔壁上和产生气泡。试剂如用滴瓶滴加除要注意滴加速度外,滴加的角度也很重要。4温度和时间对检测结果的影响这是ELISA测定中影响成败的最为关键的一个因素,也是容易出现问题的一步,抗原抗体的结合反应进行,必须在一定的温度条件下反应一定的时间。最为常见的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8℃。目前国内试剂的温育时间为37℃0.5~1h,进口试剂则通常为37℃1~2h。一般来说抗原抗体反应在37℃下需要1~2h才能较完全的结合,低于1h可能会影响测定下限。关于温育,在实际操作中应注意以下几方面。4.1根据所需时间,选择合适的模块温度一般来说,加完样本与反应试剂后,将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃,需要一定的时间,尤其在室温较低的时候或在非水浴的状态下。因此,为保证37℃条件下足够的温育时间,临床实验室应自行确定本实验室在不同季节不同温度下将微孔板从室温下拿至温箱后,需要多长时间孔内温度才能达到37℃,从而适当延长板条在温箱中放置的时间。具体的做法是,用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。4.2反应时间和温度在有的ELISA试剂盒说明书中,指出的温育温度可有两种,例如,一种是37℃下1h,另一种则为43℃下45min。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看,在较低的温度下反应较长的时间最为完全,如2~8℃下反应24h。较高的反应温度,由于分子运动的加快,反应时间缩短,这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没问题,但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此,建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。4.3力学梯度“边缘效应”,即外周孔显色较中心孔深的现象。有研究证实,在温育中的热力学梯度可能是该现象的根本原因之所在。因此,使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时,将板和溶液均加热至温育温度,就可以很容易地排除“边缘效应”,并且可提高测定的重复性。5显色剂的配置显色比色的环节也相当重要,洗板的充分性和洗板后的残留液是关键,将直接影响显色。目前所使用的显色剂大部分是以四甲基联苯胺(TMB)为底物的,在整个显色的过程中不须要避光,操作比较简单。如果是以邻苯二胺(OPD)显色的试剂,必须在使用前30min内进行配置,而且需要避光。对于比色来讲,主要是波长的选定。6定量测定标准ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量两大类。定性测定只是对标本中是否有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论,分别用“阳性”和“阴性”表示。判断标准主要是依据试剂盒所确定的(cut-off)。而定量测定则是对标本中待测物的多少进行量值的测定,以具体数字表示。依据试剂盒所带标准品同时