elisa检测结果准确性的主要影响因素

elisa检测结果准确性的主要影响因素

目前，抗病性的诊断主要依靠实验室检测它们的抗生素。大多数检测方法采用酶联免疫吸附试验（elisa），elisa试验敏感性高。如何保证结果的准确可靠,现结合自己工作实际,就影响ELISA检测结果的主要因素浅析如下。1elisa检测临床检验和临界值质控血清的实际使用情况临床分试剂盒质量直接影响结果准确性。1994年10月起国家对体外诊断试剂统一实行批批检定,但同一项目试剂厂家很多,能通过批批检只是达到起码要求。我们的经验是:根据同行对试剂盒的使用情况;部分常用项目根据卫生部临床检验中心对参加室间质评实验室试剂盒实际使用情况综合评价;使用临界值质控血清进行实际检测比较,选择灵敏度和准确度高、特异性强试剂盒。通常ELISA试剂盒的效期是根据酶结合物的稳定性确定,酶结合物是试剂盒的核心组分,要防止反复冻融。同时使用过程中要做到“即取即用即收”,减少酶的失活,或选择小包装试剂盒。2a项目结果的影响标本质量对结果的影响不容忽视,最常用的标本为血清(血浆)。首先加样一定要在血块完全收缩分离血清后进行(血浆标本离心要充分),否则纤维蛋白吸附于孔底不易被洗掉,易导致假阳性结果。另外,溶血对部分ELISA项目结果也有影响,我们曾用HBsAg、抗HCV阳性标本各5份,取血浆配制不同RBC浓度的悬液,置低温冰冻溶血后,与血浆同时检测,表明15%以上浓度红细胞造成的溶血可导致HBsAg结果的假阳性,对抗HCV结果影响小,原因可能为HBsAg测定标本用量大(50μl),血红蛋白与聚乙烯板竞争性结合,血红蛋白本身具有过氧化物酶的作用,当加入底物显色剂后可催化底物显色。另外,抽血用试管应用玻璃试管,有报道用一次性塑料试管盛血,进行乙肝两对半试验,因聚乙烯易吸附抗原或抗体蛋白,其结果在4h后明显偏低,尤其是抗原或抗体滴度较低时,而大多数实验室的免疫项目并非每天都做,诸如乙肝两对半、抗-HCV等每周1～2d。3移液器的使用国内大多数抗-HCV、抗-HIV等试验所需标本仅10μl,多加或少加1μl即有10%的误差。笔者用2μg/LHBsAg质控血清进行试验,加样量分别为50μl、45μl,其余条件完全一致,结果测定吸光度分别为0.405±0.026和0.288±0.047(P<0.001)。因此,移液器的准确性需要经常进行校验,有条件的情况下使用进口移液器,同时移液器与移液吸头连接要紧,取样时吸头插进液面3～5mm,否则吸头外壁粘有血清较多;吸头不可反复洗涤使用,反复洗涤其内壁变毛糙,易吸附血清,导致加样量的不足。关于稀释液、酶结合物等的加注,目前国内部分项目试剂盒采用滴瓶滴加,由于滴瓶滴加时,滴瓶口距微孔距离的不同所加液体量不同,这样就造成稀释倍数的不一致。我们建议ELISA试剂中标本及所用每一种试剂(稀释液、酶结合物、对照等)均应尽量使用移液器加注。至于稀释方式,陈宇认为以在孔内加入稀释液再加标本,同时用移液器吹吸三次混匀为好。经我们验证,该方式切实可行,尤其适用于使用蛋白变色稀释液试剂盒,可避免加样错误(如华美生物工程公司的抗-HCV、抗-HIV等)。4反应板着试管架上不正确通常为37℃水浴箱,水浴箱的指示为水的温度,但须注意的是有的实验室将反应板放在试管架上不正确,应将反应板漂浮在水上或将水加至与试管架相平或稍高出试管架;箱盖也不宜常打开,否则反应实际温度不够(尤其是冬季),测量吸光度下降,易导致低浓度标本的假阳性结果。5残余量和浸泡时间分手工法和洗板法。手工法洗板时每洗一次宜在吸水纸上拍干,一般洗涤效果都有保证。用洗板机洗板时,最重要的是控制好微孔液体残余量(小于2μ1)和浸泡时间(大于45s),残余量过多,极易导致洗板不净和假阳性结果的发生。我们的经验是在洗涤次数总数不变的情况下分两步洗涤,中途拍板一次即可;同时洗板时人不能离开,应随时观察针头注液情况,发现针头堵塞及时疏通;一旦发生反应板某一排结果全阳性,应排除针头堵塞可能,最好对这些标本进行复检。另外不同试剂盒洗涤液不可交叉使用。6保存不当时二甲基联苯胺tma目前国产ELISA试剂盒的色原底物常为A、B两种液体,一种为一定浓度的双氧水,另一种为四甲基联苯胺(TMA),由于A、B两液的不稳定,使用保存不当易产生颜色,使用时发现有颜色时必须丢弃;显色时应先加A液,后加B液,时间必须严格按说明书进行,终止反应后须在15min内比色,否则随时间的延长,吸光度下降,导致假阴性结果的发生。7试验质控监测正确的检验结果来自于实验室的质控体系。ELISA试验要重视做好室内质控,其方法多借助于室内质控血清,每次检测时与常规标本同时进行。以HBsAg为例,质控血清有高、中、低值及阴性值质控物,其中以低值(弱阳性-临界值)质控物最为重要,弱阳性-临界值质控物监测是检测精密度观察的最敏感窗口,也是提示试验成功与否的最重要标志;但须注意的是弱阳性-临界值质控物绝不是判断结果的标准。质控物同样要避免反复冻融,因反复冻融可使蛋白质变性抗原成分及空间构象发生改变。ELISA试验质控方法,由于试剂盒效期短,我们主张用“