双壳贝类中扇贝毒素和原多甲藻酸的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法分析

双壳贝类中扇贝毒素和原多甲藻酸的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法分析

随着海洋环境的恶化，赤潮频繁爆发，赤潮的破坏之一是它能产生和分泌毒素。这些毒素经贝类和鱼类体内蓄积通过食物链进入人体,严重危害食用者的身体健康,甚至威胁生命。海洋贝类毒素根据其对人类引发中毒的症状和藻源进行分类可分为麻痹性贝毒、腹泻性贝毒、神经性贝毒和记忆缺失性贝毒。如果按照化学结构来区分,麻痹性贝毒属于生物碱类物质,是亲水性毒素,而后三种贝毒一般是亲脂性的聚醚化合物。腹泻性贝毒最初是指软海绵酸OA和它的衍生物鳍藻毒素DTXs,随着科研工作的不断深入,研究者陆续发现了一些新型贝类毒素。如扇贝毒素PTXs、虾夷扇贝毒素YTXs和原多甲藻酸贝毒AZAs等在结构、毒性上与OA有差异,但这几种毒素成分通常在贝中与OA和DTXs共存,一直以来也被归为腹泻性贝类毒素。FAO/IOC/WHO于2004年3月在都柏林(Dublin)举行的关于贝类生物毒素会议上,重新按化学结构将贝类生物毒素分为8组,AZA2属于原多甲藻酸(Azaspirzcids)组,PTX2属于扇贝毒素(Pectenotoxins)组。AZAs可引起恶心、呕吐、腹泻、胃痉挛等中毒症状,PTXs虽不会引起腹泻,但会损伤肝脏。近年来对中国沿海部分海区贝类毒素的调查显示,中国双壳贝类已经受到了贝类毒素的污染。辽东湾、胶州湾、莱州湾、秦皇岛、福建等海域均发现腹泻性贝类毒素,对生态环境及水产养殖业造成严重的威胁。我国腹泻性贝毒的研究比较滞后,主要是使用小鼠生物法、ELISA法和高效液相色谱结合柱前或柱后衍生-荧光检测技术检测贝类样品的报道。质谱作为一种新兴的高灵敏、高特异性的检测手段,在贝类毒素的研究领域必将占有重要的地位。早期上海出入境检验检疫局方晓明等在贝类毒素的分析检测上做了较多基础性研究,他们利用液相色谱-飞行时间质谱联用技术(LC-TOF-MS)进行贝类样品的腹泻性贝毒大田软海绵酸、神经性贝毒短裸甲藻毒素A、记忆缺失性贝毒软骨藻酸的检测研究,但在贝毒数量、样品种类上还有待拓宽。近年来,有多位学者采用液相色谱质谱联用技术分析了贝类组织中的亲脂性贝毒,首次发现了我国贝类中存在PTX-2sa,在我国北海缘齿牡蛎中发现了螺旋环亚胺类毒素GYM。欧盟对AZAs和PTXs的安全限量分别为160μg/kg贝类组织和150μg/kg贝类组织。但欧洲食品安全局发表研究报告建议降低AZAs的安全限量到30μg/kg贝类组织、降低OA类的安全限量到45μg/kg贝类组织。这暗示着降低贝毒的安全限量标准是全球范围内的趋势,也对检测方法的灵敏度提出了更高的挑战。本文基于固相萃取纯化浓缩、液相色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)多反应监测模式(MRM),测定双壳贝类中的两种亲脂性贝毒AZA2和PTX2。通过优化固相萃取条件,结合高灵敏的串联质谱检测技术,提高了分析灵敏度,使得AZA2和PTX2的检出限分别为0.013μg/kg、0.085μg/kg,大大低于欧盟的限量标准和相关文献值。1材料和方法1.1试验设备及试剂岛津UFLCXR液相色谱分离系统(日本岛津公司)、AB5500型三重四级杆质谱仪(美国应用生物系统公司)、Millipore超纯水过滤装置(美国Millipore公司)、LegendRT型高速离心机(德国Heraeus公司)、HGC-24型氮吹仪(天津恒奥科技有限公司)、反相Shim-packXR-ODSHPLC分离柱(150mm×2.0mm)、OasisHLB3cc(60mg)固相萃取小柱(美国Waters公司)。乙腈(HPLC级,批号:124571)、甲醇(HPLC级,批号:50102)、甲酸(质量分数98%~100%,批号:K32719063346)均购自德国Merck公司;甲酸铵(HPLC,Tedia,批号:200287)、氨水(分析纯,批号:T20121021),贝类毒素标准品购自加拿大国家研究委员会海洋生物科学研究所,其中,扇贝毒素PTX2浓度为8.6μg/ml±0.3μg/ml、原多甲藻酸AZA2浓度为1.28μg/ml±0.05μg/ml。试验用水均来自Milli-Q系统。试验样品紫贻贝(淡菜)、牡蛎、扇贝购自宁波象山某菜场。1.2方法1.2.1上清液上清液的制备取贝类可食部分混合,捣匀。称取约2g捣匀的贝类组织于15ml塑料离心管中,加入5ml甲醇,涡旋振荡1min,静置10min,于25℃、10000r/min转速下离心5min,离心所得的上清液转移至25ml刻度试管中。按照上述提取步骤再重复提取2次,合并提取液,用纯水定容至刻度。1.2.2扫干、洗脱OasisHLB3cc(60mg)固相萃取小柱依次用3ml甲醇、3ml水活化后,保持柱体湿润。将上述经水稀释过的贝类组织提取液(水/甲醇体积比为2∶3)转移到此活化好的小柱上,流速不能超过1滴/s,待上样完毕,以5ml甲醇/水(体积比为1∶3)淋洗小柱,在低真空度下减压抽干小柱,最后被分析物依次用2.5ml甲醇和2.5ml5%氨化甲醇洗脱。收集洗脱液,于40℃下用N2吹至近干,加入2ml甲醇∶水(体积比1∶1)充分溶解,用0.20μm滤膜过滤,滤液供HPLC/MS/MS测定。1.2.3标准品溶液配制AZA2、PTX2混合标准储备液由购买的贝毒标准品以甲醇/水(体积比1∶1)稀释而得,浓度分别为25.6ng/ml、172ng/ml,置于-20℃冰箱保存备用。1.2.4标准储备液pt2005称取7份空白扇贝样品,依照以上样品提取和固相萃取步骤,最终得到7份2ml空白扇贝基质提取液,往这7份空白基质中加入不同体积AZA2、PTX2的混合标准储备液,得到一系列含有不同浓度AZA2和PTX2的基质溶液,其中AZA2浓度为0.128ng/ml、0.256ng/ml、0.512ng/ml、1.024ng/ml、2.048ng/ml、4.096ng/ml、8.20ng/ml;PTX2浓度为0.86ng/ml、1.72ng/ml、3.44ng/ml、6.88ng/ml、13.76ng/ml、27.52ng/ml、55.04ng/ml;利用此基质工作溶液绘制基质匹配标准曲线。1.2.5流动相、线性梯度洗脱程序色谱条件色谱柱为Shim-packXR-ODS分离柱(150mm×2.0mm);柱温:40℃;进样量:5μl;流动相A为水相,含2mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸;流动相B为乙腈,含0.1%甲酸,线性梯度洗脱程序:0.00min~5.00min,20%B~70%B;5.00min~6.00min,70%B~85%B;6.00min~8.00min,85%B;8.00min~9.00min,85%B~20%B;5.00min~10.00min,20%B。流速:0.4ml/min。2结果与讨论2.1质谱条件优化根据待测物的性质,配制AZA2和PTX2浓度分别为25.6ng/ml、172ng/ml的标准溶液(溶剂为含2mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸的甲醇/水(1∶1,V/V)),采用注射泵进样的方式进行质谱条件优化。试验发现,AZA2和PTX2在ESI正离子模式下质谱信号强,通过母离子扫描分析,确定AZA2的母离子为[M+H]+,PTX2的母离子为[M+NH4]+。对选定的母离子进行子离子扫描,选取丰度相对最强的子离子为定量离子,其次的为定性离子,再分别对子离子的碰撞能进行了优化,最后采用多反应监测模式对待测物进行定性和定量分析。色谱分离方面,选取反相ODS分离柱有利于亲脂性贝毒的保留,同时选取含2mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸的水相A及含0.1%甲酸的乙腈溶液作为流动相,较之单纯以乙腈水作为流动相,离子化效率高,峰形好。提高有机相比例有利于目标分析物的流出,但粗提取液里的杂质也一并流出。通过设置梯度洗脱,在低比例有机相的条件下先洗脱出亲水性的杂质,待目标分析物流出后,提高有机相比例,把粗提取液中的强疏水性杂质洗脱下来,这样可更有效地排除干扰。图1为两种亲脂性贝类毒素标准溶液在优化的HPLC/MS/MS条件下得到的MRM图谱。2.2固相萃取条件的优化2.2.1样品的采集和测定OasisHLB固相萃取小柱广泛应用于酸性、中性及碱性化合物的纯化浓缩,可以预测OasisHLB小柱对AZA2和PTX2具有良好的吸附效果。在试验中,贝类样品经由甲醇提取,所得到的甲醇提取液如果直接上样,目标分析物即随着甲醇一起流出柱外,回收率几乎为零。所以,尤为重要的一点是确定上样溶液中水的比例,以保证目标分析物在萃取小柱上完全保留。具体步骤如下:1.5ml含水百分比分别为0%、25%、35%、40%、50%和75%的PTX2(3.44ng/ml)和AZA2(0.51ng/ml)的混合标准溶液上样到已活化好的小柱上,用1ml水淋洗,抽至近干,再用3ml甲醇洗脱。分别收集上样滤出液、淋洗液和洗脱液,量出它们的精确体积,与相同浓度的混合标准溶液峰强对比,计算出上样滤出液、淋洗液和洗脱液中所含目标分析物的百分比,百分比数据已列于表1中。从表1中可以看出,采用纯甲醇溶液直接上样,在上样滤出液和淋洗液中检测到绝大部分目标分析物,而洗脱液中的目标分析物几乎可忽略不计,这表明甲醇溶液中的目标分析物基本未被吸附到小柱上。升高上样溶液中水的比例到25%,上样滤出液中仍能检测到7%的AZA2,当水的比例升高到35%时,上样滤出液和淋洗液中均未检测到AZA2和PTX2,但洗脱液中的含量剧增,继续升高上样液中水的含量到40%,洗脱液中目标分析物仍有增加,当增加到一定程度后,洗脱液中目标分析物的含量基本不变。最终,我们将样品提取液稀释成含水40%的溶液再上样,保证100%上样率。2.2.2淋洗液的选择淋洗可去除柱上保留的盐类和强极性的物质,一般采用低有机相的淋洗液来去除杂质。从上述上样液的优化过程来看,含水比例大于40%的上样液即可完全避免被分析物在柱上的损失,理论上采用含水百分比为40%的甲醇水溶液作为淋洗液使被分析物不会造成损失。保险起见,试验中选择甲醇/水(1︰3,含水百分比为75%)的溶液作为淋洗液。洗脱过程中,对于HLB小柱一般采用纯甲醇溶液作为洗脱液,但对于胺类化合物,像AZA2,最好选择弱碱性洗脱液。试验中考察了5ml纯甲醇(A)、2.5ml甲醇+2.5ml1%氨化甲醇(B)、5ml1%氨化甲醇(C)作为洗脱液对目标分析物回收率的影响。试验结果显示,三种洗脱液都对AZA2和PTX2有着良好的洗脱效果(回收率>90%),其中B和C优于A,为了更有利于溶剂的挥发,折中选择B作为洗脱液。2.3基质效应的考察试验中发现试样经过SPE小柱净化浓缩后,存在一定的基质效应。基质效应的消除和校正方法一般有内标法、标准加入法、基质匹配标准曲线法以及一些样品净化和改变色谱分离条件的方法。本试验采用标准加入法来考察样品中基质对目标分析物的影响:往经过SPE纯化浓缩后的空白基质中加入混合标准溶液,所得的响应值与同浓度标准溶液的响应值比较,即可分析PTX2和AZA2在样品中的基质效应。试验结果表明,样品基质对目标分析物具有一定的基质抑制效应,通过计算得出PTX2和AZA2的基质抑制效应分别为45%、22%。另外,还考察了未经过SPE纯化浓缩的粗提取液对分析物所造成的基质效应,发现粗提取液中的基质对目标分析物的响应值几乎无影响。说明SPE纯化浓缩目标分析物的同时基质也被浓缩,浓缩后的基质对目标物造成了基质抑制效应。由于基质抑制效应引起的灵敏度下降抵消了一部分由浓缩所提高的灵敏度,试验中只要满足SPE的浓缩倍数超过2即有利于提高整个方法的灵敏度。本试验中SPE的浓缩倍数是7.5(15ml→2ml),结合串联质谱检测,使方法检出限达到0.013μg/kg~0.085μg/kg,远远低于欧盟限值。2.4方法学参数2.4.1线性范围和定量限在优化的前处理和HPLC/MS/MS条件下,对本法配制的基质匹配标准曲线进行测定,以各分析物的定量离子的峰面积y对其在溶液中的浓度x(ng/ml)进行线性拟合,得到PTX2和AZA2在基质溶液中的线性方程、相关系数和线性范围。采用在空白基质添加目标组分的方法,依据色谱峰的信噪比(S/N)等于3确定检出限(LOD),S/N等于10确定定量限(LOQ),数据见表2。两种分析物在低浓度范围内线性关系良好,其基质匹配标准曲线的线性相关系数达到0.999;PTX2和AZA2的LOQ达到0.28ng/ml和0.043ng/ml。2.4.2标准曲线的制作依据欧盟非强制执行法案2002/657/EC的要求,如果不具备标准参考物质作为方法验证对象的条件,则需进行方法加标回收试验。本方法采用不含待测物的扇贝作为空白样品,分别加入3种不同浓度水平(低、中、高)的PTX2和AZA2混合标准溶液,放置过夜。次日按照以上SPE操作步骤进行样品预处理,测得分析物的峰面积按照基质匹配标准曲线计算出它们相应浓度,此浓度与加入量比较,比值即为回收率,结果见表3。从表中不难看出,此方法在低中高不同添加水平上都具有理想的加标回收率。2.4.3方法的标准测定空白扇贝基质中加入PTX2(3.44ng/ml)、AZA2(0.512ng/ml),平行测定6次,得到PTX2、AZA2的日内标准偏差分别为4.5%、6.7%;连续5d对此加标样品进行测定,并平行测定3次,得到PTX2、AZA2的日间标准偏差分别为7.8%、9.5%。加标扇贝样品平均分成6份,按照所建立的方法测定其中两种贝类毒素的含量,得到方法的标准偏差,结果显示两种贝类毒素的RSD均<7%,说明此方法具有良好的重复性。2.5样品的测定应用本研究所建立的方法对宁波象山港一带市售的60份双壳贝类,包括扇贝、贻贝及牡蛎样品进行了分析。其中有两份贻贝中检出了AZA2,浓度为0.035μg/kg;一份牡蛎样品中检出了PTX2,其浓度为0.4μg/kg;所测定的20份扇贝中均未检测到AZA2和PTX2。总体来看,AZ