基因工程菌发酵制药工艺

基因工程菌发酵制药工艺现代生物技术制药工艺生物技术制药概论基因工程菌发酵制药工艺动物细胞培养制药工艺重组蛋白质药物分离、检测与质量控制基因工程菌发酵培养制药工艺工程菌的种类与特征基因工程技术工程菌的构建工程菌的分子与细胞学基础工程菌发酵的动力学工程菌发酵的工艺与操作技术发酵过程检测与控制技术基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。发酵制药:利用微生物生长和代谢活动生产药物的过程，制药微生物:细菌、放线菌等原核细胞生物和酵母、丝状真菌等真核细胞生物。工程菌发酵制药工程菌发酵制药的基本工艺过程上游过程：（1）目标基因的克隆，（2）表达载体的构建，（3）工程菌的重组构建与保存。下游过程：（1）菌种和生产用培养基的配制，（2）培养基、发酵罐和辅助设备的无菌化操作，（3）接菌与工程菌扩大繁殖培养，（4）最适条件下发酵培养，生产目标产物，（5）产物的提取、分离与纯化，获得合格产品。工程菌发酵制药6.1基因工程菌的种类及特征大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统酵母表达系统丝状真菌表达系统工程菌发酵制药表达系统许多微生物在工业上通过发酵生产药物，由于其遗传背景、基因转录、表达等方面存在一定问题，并不是所有工业用微生物都可作为基因工程宿主菌而使用。宿主菌的生长发育及遗传各有其特点，对营养、环境等生存因素的要求也不尽同。充分了解和深入研究宿主菌的特征，才能合理选择，构建出最佳的工程菌。工程菌发酵制药表达系统G－，单细胞，杆状。裂殖，37℃17分钟繁殖一代。白色至黄白色的菌落，光滑，直径2－3mm。鞭毛，较长。无芽孢，一般无荚膜。一、大肠杆菌表达系统大肠杆菌（Eschericliacoli）形态特征工程菌发酵制药表达系统能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。生化与遗传特性工程菌发酵制药表达系统不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达:外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。通过对表达载体的改造，通常与分泌蛋白融合表达或与膜透性蛋白共表达，蛋白质分泌到细胞外的培养液中。产物表达形式工程菌发酵制药表达系统发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。大量外源基因能超量的表达，部分药物上市。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％），培养周期短，抗污染能力强。不用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。优点和不足工程菌发酵制药表达系统G＋，单细胞，芽孢。杆状，无荚膜。裂殖，31分钟繁殖一代。有鞭毛。污白至微黄色的菌落，粗造，不透明，不闪光。二、芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌（Bacillus）形态特征工程菌发酵制药表达系统革兰氏阳性菌（a）与阴性菌(b)细胞区别工程菌发酵制药表达系统好氧发酵，水解淀粉，还原硝酸盐，液化明胶。现在至少10余种芽孢杆菌可作为宿主菌。枯草芽孢杆菌的基因组：4.21Mb，有4100个开放阅读框架。生长与遗传特性工程菌发酵制药表达系统安全：不产生内毒素；大多数对人畜无致病性；分泌功能强大：产物被加工和直接释放胞外，很多商品酶是胞外蛋白；发酵后处理变得简便，直接分离产物，提高产量。存在问题：对目标产物进行降解：蛋白酶分泌量大、种类多。质粒不稳定性：有时在摇瓶阶段就检测不到了。优点与不足工程菌发酵制药表达系统酶类：碱性蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶、青霉素酶、头孢霉素酰化酶等都实现了商业化生产。营养缺陷和抗生素突变株还能进行核苷药物（肌苷、黄苷、尿苷等）、抗生素发酵。真核基因：人生长素、胃蛋白酶抑制剂、IFN、EGF、tPA、乙肝核心抗原等。应用工程菌发酵制药表达系统链霉菌（Streptomyces）重要生产抗生素的工业微生物。放线菌产生的4000多种抗生素中，链霉菌产生的约占90％。链霉素、卡那霉素、林可霉素、氯霉素、红霉素、螺旋霉素、四环类抗生素等。三、链霉菌表达系统工程菌发酵制药表达系统丝状多核单细胞原核生物，G＋，能形成孢子。固体培养：基内菌丝,气生菌丝。当营养耗竭时，激活孢子形成的条件，气生菌丝成熟并分化成孢子菌丝，断裂形成分生孢子。生长特性工程菌发酵制药表达系统基因组：约8.7Mb，7800个基因；染色体是线性，质粒是线性的。遗传特性工程菌发酵制药表达系统工业化成熟，有适合载体，就可用于大规模生产；绝大多数为非致病菌，不产生内毒素；高密度培养，生长期长，稳定期仍维持合成蛋白质；产物分泌到胞外，分离纯化较容易。前景：通过基因工程技术生产抗生素是人们正追求的目标。可用于次生代谢产物生物合成及其调控基因的表达，通过代谢工程，提高产量或生产新型杂合抗生素。优点与不足工程菌发酵制药表达系统单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形或香肠形。芽殖、裂殖为主。在特定条件下才产生子囊孢子。在固体培养基上，菌落乳白色，有光泽，边沿整齐。四、酵母表达系统形态特征工程菌发酵制药表达系统孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景相当清楚。基因组：120.68Mb，阅读开放开架5887个，编码约6000个基因生长与遗传特征工程菌发酵制药表达系统五种类型的载体，——安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。优点与不足工程菌发酵制药表达系统1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素Merck公司：乙肝疫苗，FDA批准的酿酒酵母表达的第一个基因工程疫苗Novo－Nordisk公司：人胰岛素Immunex公司：人粒细胞集落刺激因子应用工程菌发酵制药表达系统菌丝体分枝的真核细胞微生物，是非常重要的一类发酵和制药工业微生物。工业酶：淀粉糖化酶、果胶酶、脂肪酶、半乳糖苷酶有机酸：马来酸、乳酸、草酸、柠檬酸、氨基酸药物：维生素、抗生素（青霉素、头孢霉素、灰黄霉素等）、生物碱（麦角碱、圆弧菌素等）等五、丝状真菌工程菌发酵制药表达系统在固体培养基上，形成基内菌丝和气生菌丝，菌落圆形，较大而松疏，不透明，呈现绒毛状、棉絮状、网索状等，产生色素，呈现各种颜色。孢子萌发形成菌丝，生长分枝形成初级菌丝体，不同性别菌丝体接合形成次级菌丝体，二倍体细胞。黑霉青霉形态与生长特征工程菌发酵制药表达系统用天然质粒作为载体只成功了少数几例。以细菌质粒为基本结构，插入真菌启动子和选择基因、功能基因构建表达载体。已有多种真菌实现了DNA的转化，建立了转化系统。黑曲霉和木霉表达凝乳酶、毛霉表达天门冬酰胺蛋白酶、米曲霉表达脂酶、淀粉酶和葡萄糖淀粉酶等。药用蛋白质表达宿主菌主要有构巢曲霉系统，载体包括aclA启动子、真菌分泌信号肽的公共序列和glaA终止序列，已实现了重组人细胞因子药物的分泌表达。载体研究工程菌发酵制药表达系统（1）工业化发酵技术成熟，发酵产品产量高；（2）米曲霉和黑曲霉是FDA和WHO认定的安全生产菌，是优先可接受的宿主菌；（3）分泌能力强，有利于分离纯化下游工序；（4）蛋白质的翻译后的加工修饰，糖基化、二硫键形成及肽链的正确折叠等，表达出功能蛋白质。缺点：许多基础研究滞后，限制着其深入应用。基因表达的转录调控、载体、转化、外源基因整合优点与不足工程菌发酵制药表达系统6.2基因工程技术概念：无性繁殖生成的遗传均一的生物群体。个体克隆：植物细胞培养形成完整的植株，动物胚胎/体细胞的核移植，发育形成个体。细胞克隆：由一个细胞生成一群细胞即细胞群。基因克隆：由少量（单拷贝）基因扩增产生大量（高拷贝）基因。分子克隆策略：化学合成－已知序列（60－80bp）;生物合成（基因扩增）(已知部分或全部序列)；文库筛选应用：测序，功能研究，诊断与检测，物质生产…一、基因克隆（Clone）PCR原理与技术1、原理1971年，Kleppe等首先描述了基因合成的基本原理PCR技术发明人：KaryMullis（Cetus公司）1983年，构想DNA链的合成。1985年，Klenow片段扩增出哺乳动物单拷贝基因1993年，获得诺贝尔化学奖。聚合酶链式反应：Polymerasechainreaction，PCR分子生物学技术，生物体外进行，扩增DNA片段。通常不超过10kb,特定方法扩增40kb左右。PCR原理：细胞内的在DNA聚合酶催化下的DNA的复制过程，利用反复相同程序，DNA聚合酶在体外扩增特定的DNA片段。变性94℃退火55℃延伸72℃第1轮第2轮第3轮指数增加加热方式：水加热，空气加热，电热丝加热，半导体+电热丝致冷方式：水致冷，空气致冷，压缩机致冷，半导体致冷温控系统仪器构造：三传感器，双区域温度--温度梯度样品池传感热敏元件热泵热池2、PCR仪原理计算机芯片控制过程参数ThePCRJetfromMegaBasegivesfastPCRwithlargesamples.2、PCR仪，热循环仪Morereactionsinthesamespacewith1,536wells3、操作过程PCR反应的基本组分：DNA模板：含靶基因的DNA片段引物：1对人工合成的短寡核苷酸，18－25nt，决定扩增的起始和终止位置及扩增长度DNA聚合酶：作用是催化合成复制扩增的区域底物：4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，A、T、G、C缓冲体系:提供适合聚合酶行使功能的化学环境。石蜡油：防止蒸发；管盖（可加热）封闭反应管PCR的条件与循环参数第1步：1个循环，94℃变性，1－5min。破坏氢键，双链DNA解离,形成单链。第2步：25－40个循环，变性(94-96℃，1-2min)——退火（降低温度使得引物结合到模板的特定序列上。55℃，1-2min)——延伸（DNA聚合酶由引物的3端开始，沿着DNA链合成新的互补链。72℃，1000bp/min)。第3步：强化延伸，72℃，7－13min第4步：终止反应（4℃）PCR反应在热循环仪（PCR仪）中自动化进行。反应控制：温度的加热或冷却过程，关键是每步反应温度精确，升温和降温的时间控制。二、基因重组技术基因重组概念：在体外，将不同的基因通过切割、连接，重组形成杂合分子。插入到合适的载体分子上，转化到宿主细胞中。随着细胞的繁殖，基因得以真实复制扩增和表达。应用：测序，修饰和改造基因，表达编码产物。传统的重组技术酶切反应载体目标基因可连接的末端连接反应转化重组分子重组子1、DNA片段的酶切限制性内切酶催化双链DNA分子断裂，形成相应的片段。反应体系组成：双链DNA、限制性内切酶、缓冲液组成反应条件：一般在37℃反应1小时。2、DNA片段的连接DNA连接酶催化两条断开的DNA双链分子，形成3,5-磷酸二酯键，得到重组DNA分子。反应体系组成：2个DNA片段（具有可连接的末端）、连接酶、缓冲液条件：一般在10－26℃下，反应0.5-8小时3、重组DNA分子的转化转化；将重组DNA分子导入到宿主细胞的过程。Ca2+诱导转化：重组分子与宿主细胞在CaCl2中混合，冰浴30min，42℃热击（90s），冷却3min。转染:利用噬菌体或病毒的感染，把外源基因导入受体细胞内。PEG介导的原生质体转化，电穿孔转化,基因枪转化，农杆菌介导的植物转化等。4、转化细胞的扩增培养宿主细胞经转化后立即进行短时间的培养，使细胞增殖达到一定数目，以利于筛选和鉴定。5、重组子的筛选与鉴定从混合体系中把期望重组子（只含有目标基因的重组子）分离出来，去除其他非期望重组子和非转化细胞。载体遗传标记筛选：抗生素抗性筛选，营养缺陷性筛选，α互补筛选，噬菌斑筛选目标基因序列的检测：菌落原位杂交，测序测定，产物检测。6.3基因工程菌的构建大肠杆菌表达载体的设计表达载体的构建工程菌的构建表达载体：在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。外源基因表达盒：启动子、功能基因和终止子组成。融合载体：在目标基因的上游或下游设计运载蛋白基因、信号蛋白基因、寡肽标签，表达融合蛋白。增加溶解性和防止产物降解，定向分泌和亲和纯化。启动子是最关键的元件，决定着表达的类型和产量。目标基因终止子启动子一、表达载体的设计表达载体结构工程菌发酵制药工程菌构建lac启动子：受cAMP激活蛋白（CAP）的正调控和lacI负调控。CAP－cAMP复合物与操纵子结合后，促进了RNA聚合酶与启动子结合，开启基因转录。lacI形成四聚体，与操纵基因结合，阻止转录起始IPTG等乳糖类似物是lac操纵子的诱导物IPTG与lacI结合，解除lacI的阻遏作用，激活基因转录。大肠杆菌系统的启动子工程菌发酵制药工程菌构建最大程度诱导lac启动子需要CAP参与，在缺乏葡萄糖时，CAP活性很高。因此，培养基不能使用葡萄糖作碳源。使用lacI温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)，可改变lac启动子为温度敏感型。在低温（30℃）下抑制表达，高温（42℃）下启动基因表达。实现温敏控制，而不使用IPTG。工程菌发酵制药工程菌构建tac启动子、trc启动子：仅受lacI调控，不受CAP调控，基因表达水平比lac启动子更高。T7噬菌体启动子：受T7RNA聚合酶高度调控的，比大肠杆菌RNA聚合酶高数倍。受lacI阻遏，被IPTG诱导表达。T7启动子是目前基因表达水平最高的。优点:T7RNA聚合酶只识别染色体外T7启动子，持续合成，转录大肠杆菌RNA聚合酶不能有效转录基因。工程菌发酵制药工程菌构建PL、PR启动子:受温度敏感型阻遏物cIts857调控，在低温（30℃）下阻遏物有活性，抑制转录，而高温（42℃）下阻遏物失活，驱动转录。优点：温度诱导，成本低。对宿主菌有毒性的产物的表达非常有利。缺点：产物容易聚集形成包涵体。工程菌发酵制药工程菌构建融合色氨酸调控的cI基因PL启动子和融合蛋白等，研究构建了融合蛋白载体硫氧还蛋白融合系统谷胱甘肽S转移酶系统半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统等

其他启动子系统：工程菌发酵制药工程菌构建调控类型启动子表达条件糖半乳糖转移系统mgl，阿拉伯糖基因araB葡萄糖抑制表达，岩藻糖、阿拉伯糖诱导表达无机磷碱性磷酸酶基因，甘油3磷酸转移酶系统无机磷大于5mmol/L抑制表达，小于1mmol/L诱导表达溶氧丙酮酸甲酸裂解酶基因,硝酸还原酶基因，血红蛋白基因富氧时抑制表达，贫氧或微氧时激诱导表达pH赖氨酸脱羧酶基因cadApH>8抑制表达，pH<6诱导表达工程菌发酵制药工程菌构建二、表达载体构建目标基因的扩增——PCR反应组成：引物，模板dNTPs，DNA聚合酶，缓冲液酶切与连接反应：转化：培养与筛选：工程菌发酵制药工程菌构建重组克隆的PCR快速鉴定筛选工程菌发酵制药工程菌构建酶切鉴定工程菌发酵制药工程菌构建三、工程菌的构建对于一种表达载体，不是如何一种菌株都能对其进行有效表达。不同菌株表达能力不同，同一菌株的不同转化细胞之间可能也存在差异。对宿主菌必需进行筛选。工程菌发酵制药工程菌构建不同诱导时间下的表达工程菌发酵制药工程菌构建蛋白质存在形式分析包涵体表达工程菌发酵制药工程菌构建可溶性表达工程菌发酵制药工程菌构建工程菌发酵的物质需求工程菌发酵的环境需求工程菌的质粒稳定性6.3工程菌发酵制药的分子与细胞学基础碳源第一营养要素，其作用在于为正常生理活动和过程提供能量来源，也为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。一、工程菌发酵的物质需求工程菌发酵制药分子细胞基础碳源种类:糖类、有机酸、脂类和蛋白质类迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸不同工程菌利用碳源的能力不同：大肠杆菌能利用蛋白胨、酵母粉等蛋白质的降解物酵母只能利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质真菌不仅可以利用单糖，还能利用多糖如淀粉等高浓度表现出底物抑制作用。葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化，在发酵控制中是一个值得注意的问题。工程菌发酵制药分子细胞基础氮源为工程菌生长主要提供氮素来源氨基酸和蛋白质、核苷和核酸及其他含氮物质。可直接很好地吸收利用无机氮如氨水、铵盐等一般不能利用硝态氮，缺乏把NO3－转化成NH4＋的酶体系。几乎都能利用有机氮源如蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、黄豆饼粉、尿素等。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高选择性。有机氮源利用程度与细胞是否产生分泌相应降解酶有关。工程菌发酵制药分子细胞基础无机盐生长提供必需的矿物质磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子水和其他营养物质中的无机盐成分足以满足细胞的生长，一般情况下，在培养基中不单独添加。磷调节微生物生长与生产。发酵培养中值得重视。工程菌发酵制药分子细胞基础维持细胞生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分含有各种生长因子，一般在培养基中不单独添加。生长因子工程菌发酵制药分子细胞基础选择剂工程菌往往是具有营养缺陷或携带选择性标记基因，这些特性保证了工程菌的纯正性和质粒的稳定性。选择标记两类：营养缺陷互补和抗生素抗性。卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型，亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。工程菌发酵制药分子细胞基础诱导表达型工程菌，在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。使用Lac启动子表达系统，基因表达阶段需要IPTG诱导。甲基营养型酵母，加入甲醇进行诱导。诱导物成为产物表达必不可少的。抗生素等次生产物发酵，添加前体和促进剂，提高产量。前体可以是产物的中间体，也可以是其中的一部分。促进产物生成的物质为促进剂。诱导剂工程菌发酵制药分子细胞基础二、工程菌发酵的环境需求温度影响表现为三个基本点：最低温度、最适温度、最高温度。低于最低温度和高于最高温度生物无法生长繁殖，甚至死亡，在最适温度下，生长繁殖最快。嗜温生物，生存温度为10－50℃，最适温度为25－45℃。大肠杆菌和酵母生长的最低温度为10℃，大肠杆菌生长的最适温度为37℃，最高温度为45℃。酵母生长的最适温度为30℃，最高温度为40℃。工程菌发酵制药分子细胞基础生长与发酵温度不一致，不仅要考虑生长速率，还有考虑发酵速率、产物生成速率等因素。较高温度表达包涵体，较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。温度诱导的大肠杆菌表达系统，生长期维持37℃，生产期提高温度42℃。对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。工程菌发酵制药分子细胞基础溶解氧工程菌都是好氧微生物，生长过程需要大量分子氧作为氧化还原呼吸链的最终电子受体，与氢离子生成水。细胞内的其他一些反应也需要氧参与。无氧呼吸会导致大量的能量消耗，产生有机酸，对细胞生长极为不利，甚至有害。当溶解氧水平过高，导致培养基过度氧化，细胞成分由于氧化而分解，不利于菌体生长代谢。发酵过程中保证充分的供氧显得十分重要。工程菌发酵制药分子细胞基础pH值细菌喜欢偏碱性环境。大肠杆菌适宜pH为6.5～7.5，放线菌适宜pH为7.0～8.0，高于9.0和低于4.5不能生长。真菌喜欢微酸性环境，丝状真菌适宜pH为6.0～6.5，酵母适宜pH为5.0～6.0，高于10.0和低于3.0不能生长。发酵过程常常产酸，使环境pH不断下降，所以生产中要采用有效措施控制pH的变化。工程菌发酵制药分子细胞基础pH影响产物的稳定性，不同菌种的最适生长pH和最适生产pH不同。干扰素：酸性条件下稳定，在碱性条件下容易降解。中性条件下干扰素的生产能力比弱酸性条件下有所下降，酸性环境（pH5.5）有利于发挥菌株生产能力。大肠杆菌在葡萄糖培养基中发酵培养，产生并积累乙酸，在供氧不足时更明显。乙酸使菌体生长速率下降，乙酸抑制生长是非竞争性的，即使增加葡萄糖浓度也不能解除其抑制作用，乙酸也抑制基因表达，如抑制干扰素合成。工程菌发酵制药分子细胞基础渗透压环境渗透压高于细胞渗透压：细胞会失水，发生质壁分离。环境渗透压低于细胞渗透压：引起细胞过度膨大而破裂。只有细胞与环境渗透压相同，等渗状态，才能正常生长。影响渗透压:各种有机和无机物质，糖和盐类影响最大。工程菌发酵制药分子细胞基础可见光和紫外线、X射线、γ射线、β射线等对菌生长往往没有好处，反而会抑制其生长，甚至可起到杀伤作用。在培养期间要避光，并防止有外来辐射发生。光线工程菌发酵制药分子细胞基础质粒稳定性：1）质粒复制不稳定性。不正常的起始和终止、延伸时断裂及错配等都会造成质粒不稳定性，并产生单链质粒和高分子量畸型质粒。2）质粒分配不稳定性。细胞分裂时，质粒也分配，在子代细胞中分配不均一而导致部分细胞完全丢失质粒。3）质粒结构不稳定性。质粒中DNA的缺失、插入、变或重排等使质粒DNA的序列结构发生了变化，引起复制和表达的不稳定性。4）培养环境条件引起的质粒不稳定性。基质，温度等。三、工程菌的质粒稳定性工程菌发酵制药分子细胞基础随着温度升高，质粒的稳定性下降。基于温度变化的分步连续培养：第一个反应器，30℃生长培养，增加质粒稳定性，然后流入第二个反应器，42℃诱导表达。温度控制相当重要：诱导时期和适宜的诱导温度。1、培养条件对质粒稳定性的影响温度对质粒稳定性的影响:工程菌发酵制药分子细胞基础pH值对稳定性的影响：需要设法控制pH在合适的范围内工程菌发酵制药分子细胞基础氧溶解氧和搅拌对质粒稳定性的影响培养基质对质粒稳定性的影响：培养操作方式对质粒稳定性的影响:质粒稳定性是质粒、宿主菌与培养环境三者之间相互作用的结果，各种影响因素对不同宿主菌的作用不同。通过基因操作策略构建高稳定性的重组质粒：重组缺陷菌株为受体菌。使用无转座子的质粒。使用par基因。优化培养条件及过程控制而提高质粒稳定性：诱导性表达型质粒，如温度敏感和化学物质刺激后，才合成目标产物，把生长和生产阶段分开。对于一定结构质粒，筛选适宜宿主菌，优化培养条件与工艺，提高稳定性，对基因工程药物生产具有重要的意义。3、提高质粒稳定性的策略工程菌发酵制药分子细胞基础

工程菌生长的发酵模型批式操作的基本动力学过程影响动力学的因素质粒稳定性的动力学基质利用、产物生成动力学6.5工程菌的发酵动力学

发酵动力学:研究工程菌生长、基质利用和产物生成之间的相互关系，为工程化控制提供依据。发酵体系：多相（气液固）、多组分（基质、代谢产物）、细胞变化（分裂、变异、死亡）的非线性系统。

工程菌发酵制药动力学

一、工程菌生长的发酵模型模型I：细胞均一的非结构模型。细胞之间、不同时期组成及代谢特性没有差异，均衡生长模型，研究细胞群体生长代谢规律。模型Ⅱ：细胞均一的结构模型。细胞之间无差异但细胞的组成不同模型Ⅲ：细胞非均一的非结构模型。细胞之间有差异，但不考虑细胞内部组成和结构的差异。模型Ⅳ：离散结构模型。细胞之间有差异不均一。细胞内部组成多组分、结构有差异，是细胞培养过程实际情况。

细胞非均一的结构模型细胞均一的结构模型细胞均一的非结构模型细胞非均一非结构模型细胞水平的结构模型群体水平结构模型工程菌发酵制药动力学二、工程菌发酵培养的基本动力学过程把菌体生物量、基质浓度、产物浓度等随发酵时间的变化所作的曲线称为动力学曲线。速率表示:单位时间内某一参数的变化；比速率表示:单位细胞的生物量为基准，表示该参数的变化速率。工程菌发酵制药动力学以单位时间内菌体浓度或质量（X）的变化,生长速率r和比生长速率μ分别为：比生长速率是生长速率的标准化，反映了菌体活力的大小。r=dX/dtμ=(dX/dt)/(1/X)

菌体生物量与时间的关系是S形曲线。分为四个阶段，即延滞期、指数生长期（对数生长期）、减速生长期、静止期和衰亡期。工程菌发酵制药动力学接种后，生物量没有增加的一段时间。延滞期的长短是由菌体与环境相互作用的程度决定，不同接种量、不同菌种和菌龄等而表现不同。接种对数期的菌种，延滞期比其他阶段都短，生产中用对数期进行放大和发酵生产。1.延滞期工程菌发酵制药动力学2.对数生长期工程菌快速生长繁殖阶段，生物量增加呈现对数速度增长。菌体生长速率与生物量是一级动力学关系：dX/dt=μmaxX

对数期比生长速率达到最大值，并保持不变。工程菌发酵制药动力学生长速率下降的一段时间。原因：基质浓度下降，有害物质积累。生长速率与菌体浓度仍符合一级动力学关系。3.减速期工程菌发酵制药动力学4.静止期或稳定期净生长速率为零的一段时间。增殖与死亡同步进行，生长速率与死亡速率相等。dX/dt=(μ-kd)X=0目标产物生成阶段，进行补料，延长静止期，提高产物。工程菌发酵制药动力学4.衰亡期死亡速率大于生长速率的一段时间。死亡速率也符合一级动力学：dX/dt=-kdX分批发酵，大多数在衰亡期到来前结束发酵，进行放罐。工程菌发酵制药动力学三、影响动力学的因素1.基质浓度菌体生长过程，基质逐渐被吸收利用，浓度呈现降低。基质浓度的减少可用基质消耗速率和比消耗速率表示：rs

=dS/dtqs

=(dS/dt)/(1/X)

比消耗速率表示基质被利用的效率，可用于不同微生物之间的发酵效率的比较。工程菌发酵制药动力学限制性基质浓度与比生长速率的关系可用Monod方程表示：μ=μmaxS/(Ks+S)μmax意义：基质对菌体的生长效率，用于不同基质之间的比较。Ks意义：菌体对基质的亲和力，Ks越小，亲和力越大，即越能被菌体良好利用。

S很低，Ks+S＝Ks，μ=μmaxS/Ks，浓度与比生长速率成正比。S很高，Ks+S＝S，μ=μmax，菌体以最大比生长速率进行生长。

工程菌发酵制药动力学2.温度随温度升高而速率增加，超过一定的温度点后，随温度升高，速率迅速下降。细胞生长速率和比生长速率与温度关系分别为：dX/dt=(μ-kd)X

μ=Aexp(-Eg/RT)3.pH值pH值对菌体生长速率的影响与温度的影响类似工程菌发酵制药动力学四、基因工程菌质粒稳定性动力学根据重组基因亚细胞定位，工程菌分为两类：1）不含有重组质粒，外源基因被整合到宿主的基因组中，不存在外源基因的丢失等问题。这类工程菌发酵的动力学与非工程菌相似，可以不考虑细胞组分、内部结构和个体之间的差异，用细胞均一的非结构模型即均衡生长模型就能满足此类工程菌生长的需求分析。工程菌发酵制药动力学2）携有重组质粒，外源基因以重组质粒的形式存在于细胞质中，大多数工程菌属于此类。这里讨论重组质粒类工程菌的发酵动力学过程。质粒结构的变化和分配的不均一是质粒不稳定的根本原因。工程菌发酵制药动力学发酵过程中质粒失去功能，形成两类细胞携有质粒的重组细胞：进行产物的表达，质粒数目往往不相同，每个细胞的结构是非均一的，细胞之间也存在差异。

无质粒的宿主细胞：已有很多模型对质粒稳定性进行预测。首先建立假设，尽可能是符合实际。然后动力学计算，最后实验验证。工程菌发酵制药动力学发酵过程中质粒失去功能，形成两类细胞，即携有质粒和无质粒细胞。质粒丢失率P，发酵过程中两类细胞浓度的变化率分别为：-连续发酵，基质浓度恒定，两类细胞生长动力学方程：衡态发酵，重组细胞与宿主细胞比生长速率相等，即D＝μ+＝μ-。重组细胞逐渐减少，失去质粒细胞逐渐增加工程菌发酵制药动力学携有质粒细胞数目随繁殖代数增加而减少，可用下列方程表示：Fn=[1-α-P]/[1-α-P2n(α+P-1)]这是非结构模型。原则上讲，任何一种重组微生物，只要满足上述假设应该能验证该模型。在分批发酵培养过程中，培养条件随培养时间而发生变化，因此α和P常常是变数。工程菌发酵制药动力学五、工程菌的基质利用、产物生成的动力学(一)基质利用的动力学在工程菌发酵培养过程中，通过细胞内的生物化学反应把基质转化为四类物质：（1）代谢产物，包括初级代谢产物及次生代谢产物；（2）胞外生物大分子；（3）生物量的细胞组成成分。（4）目标产物：氨基酸、异源蛋白药物等。

细胞内生物化学反应基质代谢产物生物大分子产物生物量目标产物工程菌发酵制药动力学1.重组菌基质消耗的动力学重组细胞消耗基质用于生长、活性维持和产物生成三部分，而宿主细胞消耗基质仅用于生长和活性维持二部分。分批发酵，重组细胞和宿主细胞的基质消耗速率分别为：相应地，比消耗速率分别为：工程菌发酵制药动力学2.产物生成的动力学菌体生长、能源利用和产物生成速度的变化以及其之间的动力学关系出发，发酵过程可分为三种模型：I型：菌体生长与产物生成偶联型。菌体生长与产物生成直接关联，生长期与生产期是一致，产物是菌体能量代谢的结果，基质初级分解代谢的直接产物。组成型表达的工程菌产物属于此类型。菌体生长、基质消耗、能源利用和产物生成动力学曲线几乎平行，变化趋势同步，都有最大值，出现的时间接近。工程菌发酵制药动力学II型：生长与产物生成半偶联介于偶联和非偶联模型之间，产物生成与基质消耗、能量利用之间存在间接关系。在生长期期内，无产物生成，在生长的中后期生成大量的产物，如氨基酸的发酵，一部分组成型表达的蛋白质药物属于此类型。工程菌发酵制药动力学III型：生长与产物生成非偶联型。产物降解：

生长期与产物生成期在独立的两个阶段，先形成物质消耗和生长高峰，然后菌体静止期，产物大量生成，出现产物高峰。诱导型基因工程菌，往往在静止期，加入诱导物，基因转录和产物表达。工程菌发酵制药动力学6.6工程菌发酵的工艺与操作技术发酵的基本过程培养基制备与质量控制灭菌操作与技术一、工程菌发酵的基本过程三个基本阶段：工程菌的鉴定与保存种子的扩大培养接种与发酵培养工程菌发酵制药操作技术（1）筛选单细胞克隆：（2）鉴定单细胞克隆：（3）表达量筛选：（4）鉴定表达产物的正确性：（5）质粒稳定性试验：（6）培养工艺优化：1．基因工程菌的筛选鉴定与保存从大量被转化的宿主菌中筛选出含有完整表达载体或外源基因、遗传稳定、高效表达出目标产的重组菌。基因分子操作，发酵试验，最终以发酵结果决定。工程菌发酵制药操作技术低温斜面保保存：液体石蜡密封保存：真空冷冻干燥保存：液氮超低温保存：工程菌的保存对于已构建好的工程菌要及时保存，避免优良菌种的污染、变异、质粒丢失甚至是死亡。工程菌发酵制药操作技术种子培养扩大的次数主要是由种子罐级数决定。细菌生长快，种子用量比例少，种子罐次数相应少。种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。2.工程菌种子的扩大培养将保存于试管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面或摇瓶进行活化后，再经过种子罐发酵培养逐级扩大培养，而获得一定数量和质量的纯种过程。工程菌发酵制药操作技术3.发酵培养将种子以一定的比例接入发酵罐，在适宜条件下培养。目标产物生产的关键阶段和工序。接种应该注意：菌龄和接种量。工程菌发酵制药操作技术按用途分：选择性、鉴别性、富营养培养基等按物理性质分为：固体，半固体、液体培养基按化学组成可分为：人工合成、半合成、天然培养基按发酵过程中所处位置和作用分为：斜面或平板固体培养基、种子培养基、发酵培养基和补料培养基。二、培养基制备及其质量控制技术1、培养基的种类工程菌发酵制药操作技术固体培养基：处于生产工艺流程的前端，作用是提供工程菌的生长繁殖，包括细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝状真菌孢子培养基。液体培养基添加0.8-1.5%的琼脂粉制成固体培养基。种子培养基：摇瓶和种子罐培养基,为液体。培养基成分必需完全，营养丰富，添加选择剂和缺陷化合物等对生长和选择必需的物质。用速效性、容易被利用的碳、氮源和无机盐等物质，但浓度不宜高。工程菌发酵制药操作技术发酵培养基：工程菌进行目标产物的发酵生产，不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。营养物质浓度要高些，要添加选择剂、特定的元素、前体和促进剂等对产物合成有利的物质。补料培养基：间歇或连续补加各种必要的营养物质，如碳源、氮源、前体等。补料培养基一般单一成分配制，发酵过程中各自独立控制加入。或按一定比例制成符合补料培养基加入。工程菌发酵制药操作技术控制水质：水是培养基主要成分，恒定水源和恒定水质很重要。主要参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、各种矿物特别是重金属的种类和含量。2、控制培养基的方法工程菌发酵制药操作技术来源与种类:玉米奖、淀粉等农副产品和蛋白胨、酵母粉等，因品种、产地、加工、贮存条件不同而质量差异较大。化学原料如各种无机盐类化合物，杂质含量也不相同，纯度对培养基的质量也会造成影响。不同碳源、氮源对菌种生长的能力和产物的生产能力很不相同，对代谢产物的生成影响很大。控制培养基原料的质量：工程菌发酵制药操作技术碳氮配比：原料对目标基因表达载体调控原件的影响：lac启动子，葡萄糖产生阻遏效应，乳糖有诱导效应。对trp启动子，色氨酸有调控作用。葡萄糖为碳源时，代谢副产物较多。酪蛋白水解物有利于产物合成与分泌。工程菌发酵制药操作技术控制培养基的黏度：固体不溶性成分，淀粉、黄豆粉等增加培养基黏度，影响发酵的通气搅拌等物理过程直接影响菌体对营养的利用目标产物的分离提取造成困难高黏度的培养基，也不易彻底灭菌。工程菌发酵制药操作技术控制灭菌操作：常用高压蒸气灭菌，但控制不当，容易直接影响培养基的有效成分甚至是活性。较高温度下长时间灭菌，营养成分会破坏，甚至产生有毒物质。磷酸盐与碳酸钙、镁盐、铵盐也能反应，生成沉淀或络合物，降低利用度。维生素、激素等在高温下分解破坏、失活。工程菌发酵制药操作技术制药生产用培养基的确定原则：（1）无法从生化反应原理来推断和计算出最佳培养基配方，只能根据生理学和生物化学理论，参照前人所用的经验培养基，结合基因工程菌的特殊生物学和产品特征要求，进行大量细致和周密的试验研究。（2）单因素试验：研究碳源、氮源、无机元素、诱导物及其浓度等对菌体生长和生产能力的影响。（3）均匀设计和正交试验等数理统计方法，优化培养基的组成和浓度。（4）先摇瓶进行试验，再小发酵罐试验，逐级放大。在综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。工程菌发酵制药操作技术杂菌：除生产菌以外的任何微生物。污染：感染杂菌的培养或发酵体系。污染的后果是严重，灭菌是控制杂菌的有效措施培养基、发酵设备及空间灭菌、通入空气的净化除菌消毒：杀灭或清除病原微生物，达到无害化程度，杀灭率99.9%以上。杀菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微生物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。灭菌：微生物杀灭率99.999999%以上。三、灭菌操作与技术工程菌发酵制药操作技术化学灭菌：用化学物质杀灭生物细胞的灭菌操作。化学灭菌剂有氧化剂类如高锰酸钾等，有机化合物如乙醇、甲醛等。皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及空间的灭菌。物理灭菌：各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌。效果好，操作方便，广泛使用。灭菌方法：工程菌发酵制药操作技术1、细胞高温死亡动力学与灭菌的关系细胞受热死亡的过程为一级动力学反应：－dC/dt=kdC细胞浓度与时间成反比，细胞浓度越高，灭菌时间越长。

湿热灭菌效果优于干热灭菌。以杀死芽孢的温度和时间为指标。确保彻底灭菌，实际操作中增加50％的保险系数。培养基pH、原料成分及泡沫对蒸汽灭菌效果有影响。高温会使营养成分受到一定程度破坏。工程菌发酵制药操作技术2、培养基灭菌的操作方式分批灭菌操作又称间歇灭菌：将制备好的培养基装入发酵罐，与设备一起灭菌的一种操作，也称实罐灭菌。适合于中小型发酵罐。灭菌过程：加热升温、维持灭菌温度和冷却降温。每段对灭菌的贡献，取决于升温和降温的时间长短，时间越长，贡献越大。工程菌发酵制药操作技术连续灭菌操作，高温短时灭菌操作：加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由不同的设备执行。培养基不断地从加热升温罐进入连消塔与高压蒸汽直接混匀，达到灭菌温度（130－140度）进入灭菌温度维持罐;进入冷却器;再转入已灭菌发酵罐工程菌发酵制药操作技术3、介质过滤灭菌操作技术不耐热的成分及通入的空气用过滤除灭，介质过滤除菌。原理：空气通过过滤介质，颗粒在离心场产生沉降惯性碰撞产生摩擦黏附，颗粒布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗粒，颗粒接触介质表面，直接被截留。静电引力也有一定作用。工程菌发酵制药操作技术提高空气的洁净度，除去颗粒：通过提高空气吸入口的位置和加强过滤，粗过滤器。除去空气中油和水：分级冷却，使空气冷却到20℃～25℃。油和水凝结成油滴和水滴，在空气贮罐内沉降大液滴。旋风分离器分离5μm以上的液滴，丝网除沫器分离5μm以下液滴。获得无菌空气：加热提高空气温度达30－35℃，降低湿度。经过总过滤器后，再在发酵罐前的分过滤器中进行除菌，进入发酵罐。工艺过程：三个主要工段。工程菌发酵制药操作技术6.6工程菌发酵过程的检测与控制技术

生物学参数的检测与控制物理学参数的检测与控制化学参数的检测与控制产物诱导与发酵终点控制微生物发酵生产水平:取决于生产菌种性能，合适的环境条件。掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律和监测手段，测定菌体浓度、糖、氮消耗及产物浓度，以及测定发酵罐中的培养温度、pH、溶氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。工程菌发酵制药检测与控制发酵过程的主要参数：物理参数化学参数生物学参数发酵过程各种参数处于不断变化状态以反映工程菌生长和产物形成的相关物理、化学和生物学参数为指标，用设备外在的各种装置进行检测和监测细胞代谢的变化，可以实现对发酵过程的控制。工程菌发酵制药检测与控制1.细胞形态工程菌体的形态变化能反映代谢变化。显微镜检测：用于种子质量、区分发酵阶段、控制代谢过程和发酵周期的参数。不同微生物的形态差别很大，形态检测可发现是否污染，便于控制。一、生物学检测主要的参数与控制工程菌发酵制药检测与控制2．菌种真实性试验在含有抗生素或营养缺陷的选择性平板培养基和无选择剂的培养基上生长，检测细胞所含的质粒数目和质粒结构的变化，确保发酵生产过程中菌株的生化特性和质粒的稳定性。这个过程可与杂菌检测同时进行。如果发酵生产周期短，可在发酵结束时取样，检测菌种和质粒稳定性，以控制产物的质量。工程菌发酵制药检测与控制3.细胞浓度细胞浓度：单位体积发酵培养液内菌体细胞的含量，可用干重或鲜重表示，对于单细胞工程菌也可以用细胞数目表示。通过活细胞平板稀释培养或染色后计数，总细胞数可用计数器测定。根据菌体浓度决定适宜地补料量、供氧量等，以得到最佳生产水平。工程菌发酵制药检测与控制菌体浓度与生长速率有密切关系：比生长速率大菌种，菌体浓度增长迅速，反之缓慢。在一定浓度范围内，比生长速率随着菌体浓度增加而增加.超过上限后，浓度增加会引起比生长速率下降，即前馈抑制.工程菌发酵制药检测与控制菌体浓度影响产物形成速率：在适宜的比生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。菌体浓度过高，营养消耗过快，有毒物质积累。临界浓度：摄氧速率与氧传递速率平衡时的菌体浓度,是菌体遗传特性与发酵罐氧传质特性的综合反映。发酵过程中要把菌体浓度控制在适宜的范围之内，采用中间补料、控制CO2和O2量来实现。不同菌种和产品，其控制方法也不尽相同。工程菌发酵制药检测与控制4.发酵污染杂菌的检测与控制种子污染培养基灭菌不彻底空气带菌设备及其附件渗漏工程菌发酵制药检测与控制二、物理参数的检测与控制温度压力搅拌培养基粘度通气量流加速率工程菌发酵制药检测与控制1.温度的检测与控制测定：由热电阻等热敏原件测定，温度计上读出。发酵温度：产能因素和失能因素的共同作用产生热：生物热和搅拌热散失热：蒸发热、显热和辐射热。发酵热是随时间而变化，引起发酵温度波动。对数期的生物热可作为发酵热平衡的主要依据。工程菌发酵制药检测与控制1）选择最适温度并严格控制，以期高产。2）生长阶段选择适宜的菌体生长温度，生产阶段选择最适宜的产物生产温度，进行变温控制下的发酵。3）随温度升高而目标产物的降解加强，产物的降解酶对温度更敏感，而较高温起激活作用，降低温度抑制降解是优先考虑的措施。4）两段变温发酵培养就是一种比较理想的控制模式。前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；后期：低温培养发酵，对菌体合成目标产物的能力的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解，总体提高工程菌的生产能力。

工程菌发酵制药检测与控制2.压力的检测与控制检测：罐压是指罐体内的压力，由压力表读出。罐压的影响：CO2和O2的溶解度，增加罐压，气体的溶解度提高压力影响工程菌生长，不同生物对压力耐受不同。控制罐压:调节进或出口阀门，改变进入或排出气体或空气流量，维持工艺所需压力。工程菌发酵制药检测与控制3.搅拌的检测与控制搅拌的影响：气体的传递速度和发酵液的混合均匀程度搅拌指标：搅拌转速和搅拌功率。增加搅拌转速将提高溶氧系数。过度搅拌转速对菌体产生机械剪切。搅拌控制：发酵中不同阶段对氧需求进行调节。工程菌发酵制药检测与控制4.通气的检测与控制检测：通气量来表征。通气影响供氧、废气的排出及其他传递过程。通气量的调节：通过阀门的开闭实现。5.其他参数的检测与控制表观黏度：黏度越高，对氧等气体的传递阻力越大。发酵液的黏度反映了细胞生长状态或形态，随着菌体浓度增加，黏度增加，溶解氧降低，CO2扩散困难。补料流加速率：控制流体进料的参数，用每分钟流入的体积表示。

工程菌发酵制药检测与控制三、化学参数的检测与控制基质浓度pH溶解氧尾气泡沫补料诱导表达与终点工程菌发酵制药检测与控制1.基质浓度的检测与控制基质浓度：发酵液中糖、氮、磷等发酵液中营养物质的浓度，可采用相关方法进行在线或离线检测。碳源控制：经验方法和动力学方法，通过补料控制。代谢类型确定补料时间、数量和方式。动力学方法：菌体比生长速率、糖比消耗速率、产物的比生产速率等参数控制。工程菌发酵制药检测与控制氮源控制：补加有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素等。补加无机氮源：氨水和硫酸铵。无机氮