虫草素的研究进展

虫草素的研究进展

草地昆虫素，也被称为草地昆虫素、饲料草细菌素和3'-脱氧酶（3'-deoxydeoxyme），是第一个从真菌中分离出来的抗凝酶素。早在1950年,Cunninghametal.(1950)观察到被蛹虫草Cordycepsmilitaris寄生的昆虫组织不易腐烂,进而从中分离出一种抗菌性物质,定名为虫草素,并在Nature上发表,之后许多学者对其进行了验证研究(Kaczkaetal.1964b;Frederiksenetal.1965)。虫草素分子式为C10H13N5O3,其结构式如图1,分子量为251D,碱性,针状或片状结晶。虫草素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用(王成明等2009),以虫草素为主要成分的新药已在临床上试用于白血病的治疗(Kodamaetal.2000;蔡友华和刘学铭2007),有着良好的临床应用前景,但大量提取分离其纯品非常不易,化学合成也存在一定的弊端,因此国际市场上虫草素的价格非常昂贵(Nietal.2009),虫草素的研究正成为药物化学中一个极其活跃的领域。半个多世纪以来,人们对虫草素从菌株来源、产量提高、人工合成修饰、药理活性、作用机制及产品开发等多方面进行了研究。本文从生物学的角度,对虫草素的研究现状进行综述,分析了其专利现状,并对其进一步研究提出了看法,以期为虫草素的进一步研究和开发利用提供依据。1天然菌株中的菌株组成及含量目前已报道的虫草素产生菌主要是虫草属的一些种类及从其上分离得到的菌株。除了蛹虫草子实体及其无性型蛹草拟青霉Paecilomycesmilitaris发酵菌丝体(雷帮星等2008)外,还有泰山虫草Cordycepstaishanensis(安秀荣等2007),九州虫草Cordycepskyushuensis(凌建亚等2002),蝉花Cordycepscicadae(温鲁等2006)及其无性型蝉拟青霉Paecilomycescicadae(李瑞雪等2007),香棒虫草Cordycepsbarnessii(常泓和张鹏2003),虫草头孢菌Cephalosporiumsinensis(李鑫等2003),古尼虫草Cordycepsgunnii(陈作红等2003),新疆虫草Ophiocordycepsgracilis(索菲娅等2008),蝙蝠蛾被孢霉Mortierellahepiali(陈庆涛等1986),拟黑虫草Ophiocordycepsnigrella(陈自宏等2010),蝙蝠蛾柱霉Scytalidiumhepiali(李兆兰和孙云汉1988),克列特尼棒束孢霉Isariacretacea(褚西宁等1991)等,用豆天蛾Clanisbilineata的幼虫为寄主接种蛹虫草菌得到的豆虫草中也检测到了虫草素,但是含量低于蚕蛹虫草(华春和温鲁2005)。关于天然冬虫夏草Ophiocordycepssinensis及其发酵菌丝体中虫草素的存在与否一直存在争议,本研究组在分析了不同产区的冬虫夏草子实体及不同地理来源的冬虫夏草菌株发酵菌丝体中虫草素的含量后,发现天然冬虫夏草子实体中基本不含虫草素,但是发酵菌丝体中有极其低含量的虫草素(Dong&Yao2010)。此外,Kaczkaetal.(1964a)从无冠构巢曲霉Aspergillusnidulans中分离出虫草素后没有进一步的相关报道,直到张红霞等(2006)报道了无冠构巢曲霉发酵菌丝体的虫草素产量高于蛹虫草,可以作为虫草素新的生物来源。2各虫素的生产周期尽管有上述种类的菌株可以合成虫草素,虫草素的生物合成研究却主要集中于蛹虫草。虫草素主要从蛹虫草子实体中提取,但其子实体生产周期长,导致虫草素生产成本高,制约了虫草素进一步的研究和开发利用。目前蛹虫草已实现了大规模发酵,在提高液体发酵虫草素的单位产量方面,国内外学者从菌株诱变、筛选、培养基、培养条件优化、激发子等方面开展了很多工作,取得了一些进展。2.1采用紫外诱变的方法获得烟草素产量就菌株而言,自然界原始菌株的虫草素产量往往不高,然而高产菌株的诱变和筛选报道并不多见。Dasetal.(2008)用质子束诱变(protonbeamirradiation)的方法筛选出了虫草素的高产菌株,比出发菌株的虫草素含量高出72%;李文等(2009)选择合适剂量的低能离子束注入蛹虫草,获得菌株的虫草素产量比出发菌株提高30%;周礼红等(2009)通过对蛹虫草原生质体进行紫外诱变处理,筛选出优良菌株,经固体发酵后,虫草素含量为出发菌株的2倍,连续15代传代培养,虫草素的含量依然保持稳定。航天诱变技术也用在了蛹虫草的育种研究之中。2005年8月29日中国发射的第22颗返回式科学与技术试验卫星中有3支蛹虫草试管菌种,研究表明航天搭载蛹虫草的虫草素含量较原始菌株提高2.5倍(温鲁等2008)。2.2碳氮素part和硫酸亚铁、氯化钙关于虫草素培养基的优化研究较多,基本上所有的实验均考虑到了碳源、氮源以及碳氮比的影响,但是不同的实验可能因为菌株和其他实验条件的不同,优化的碳源、氮源不尽相同,但是碳源采用葡萄糖的较多(Maoetal.2005;Masudaetal.2006)。氮源以酵母提取物(Shihetal.2007)或者酵母提取物与蛋白胨混合物(Masudaetal.2006;Guetal.2007)为主,较低的碳氮比有利于提高蛹虫草的虫草素产量(Maoetal.2005;Shihetal.2007)。Xieetal.(2009)以农副产品糙米糊(brownricepaste)、麦芽汁和大豆汁作为培养基也得到了较高产量的虫草素。无机盐离子影响虫草素的产量。在培养基中加入适量的硒可促进蛹虫草虫草素的合成(王志高等2007;贲松彬等2009);硫酸亚铁和氯化钙是影响虫草素产量的关键因子(毛先兵和马开森2004),这些离子可能作为酶的辅因子发挥作用。此外,NH4+有类似的作用,它对虫草素产量的提高可能不仅在于提供了氮源,而且与能量代谢有关,因为NH4+能激活H+-ATPase(Mao&Zhong2006)。无机盐离子的添加虽然能增加虫草素的产量,但会给后续的分离纯化鉴定等过程带来不利影响。2.3基于溶氧的合成杂草素目前关于蛹虫草的液体培养模式可分为表面培养(Surfaceculture)和深层发酵(Submergedfermentation)。Shihetal.(2007)比较了静止、摇床培养的虫草素产量和产率,发现静止培养的虫草素产量高于摇床培养,但是其达到最大产量需要更长的时间,所以产率低于摇床培养,于是提出了两段培养(先摇床培养后静止培养)的模式,能显著提高虫草素的产量和产率。静止培养和摇床培养的差别反应出溶氧水平对蛹虫草虫草素合成的调控。Mao&Zhong(2004)通过对溶氧水平的研究,提出了发酵罐溶氧调控策略:培养的前期溶氧控制在60%,当虫草素产率开始下降时将溶氧降至30%,这样虫草素的产量和产率可以分别增加15%和30%。另外补料分批培养策略也在蛹虫草虫草素的优化中得到了应用(毛先兵和涂永勤2005)。其他对蛹虫草虫草素培养条件的研究认为其最适pH为6左右(Shihetal.2007);最适温度为20-25℃,采用遮光培养能促进虫草素的合成(温鲁等2005)。除蛹虫草外,对蝉拟青霉(李瑞雪等2007)、拟黑虫草菌(陈自宏等2010)等菌株的虫草素产生条件也进行了优化,但是都低于蛹虫草虫草素的产率。2.4曲霉多糖对菌株中杂草素激发的影响前体物质及激活子对虫草素合成有促进作用,贵州大学生命科学学院真菌资源研究所在此方面开展了大量的工作并显著提高了虫草素的产量。腺嘌呤核苷和腺嘌呤是虫草素合成的前体物质,培养基中添加适量的腺苷和腺嘌呤,虫草素的产量显著提高,其中添加腺嘌呤的效果好于腺嘌呤核苷(李祝等2008;文庭池等2010)。甘氨酸、L-谷氨酰胺也能刺激蛹虫草液体发酵胞外虫草菌素产量的提高,而且和前体物质腺苷、腺嘌呤有协同作用(文庭池等2010)。步岚等(2002)将曲霉Aspergillumsp.、青霉Penicilliumsp.、根霉Rhizopussp.、疫霉Phytophthorasp.、灰霉Cinereasp.等配制的真菌激发子培养液加入到蛹拟青霉的培养物中,发现疫霉、灰霉做激发子菌株可提高虫草素的含量,但是发挥作用的成分不明;分别提取真菌多糖作为激发子,发现不同来源的多糖激发作用并不完全相同,疫霉YL和曲霉P6-1两株真菌的菌丝体多糖可以提高虫草素的产量和生物量。在发酵起始阶段加入疫霉多糖,72h后再加入曲霉多糖,虫草素的含量可达到对照的5.7倍(李祝等2006)。有意思的是,蛹虫草与红曲霉菌株MonascusrubberMT305共培养也能提高虫草素含量(周礼红和蒋春玲2008)。炭角菌属银杏内生真菌Xylariasp.YX-28菌株提取液制备的激发子和非生物型诱导子乙酸钠、硫酸铵也能促进虫草素的产生(刘小莉等2009)。在培养营养液中加入生长调节因子2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、柠檬酸三胺、秋水仙素和链霉素对提高蛹虫草子实体产量及虫草素含量有促进作用(肖正华等2010)。激素类物质如β-蜕皮激素(施明珠等2008),保幼激素Ⅲ(施明珠等2009)等也能有效地促进虫草素的产生。尽管很多前体及营养物质能增加虫草素的产量,但对它们的作用机制研究得不够深入。以腺嘌呤为例,它是虫草素的前体物质,添加后是否是因为细胞摄入量增加,从而提高虫草素合成原料的含量增加产率还有待研究。3草素的测定和分离处理方法3.1高效液相色谱法虫草素的紫外、红外光谱(陈顺志等1996)、超导核磁共振法(陈顺志等1995)可以用于虫草素的初步鉴定,而目前虫草素的分析测定多采用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析法,一般均采用反相色谱法,以十八烷基键合硅胶为固定相,流动相有很多种,如甲醇-水(85:15)、甲醇-pH6的磷酸盐缓冲液(17:3)或乙腈-水(90:10)等等。薄层色谱扫描法(thin-layerchromatographyscanning,TLCS)具有展开时间短、显色方便、价格较便宜的特点,但此法测定虫草素含量的准确度和精密度均略低于HPLC(翁梁和温鲁2008)。国内有人综合HPLC与TLCS的优点,将两者结合起来,对虫草素含量进行定性定量测定(吴洪臻等2000)。高效毛细管电泳技术(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)是近年来分析化学中发展迅速的领域之一,它兼有高压电泳的高速、高分辨率及高效液相色谱的高效等优点,同时又因其样品预处理简单,用量少,自动化程度高等优点,也用于虫草素的测定及鉴别(凌建亚等2002;徐健君等2005)。关于虫草素测定的具体方法刘东泽等(2004)进行了详细的总结。3.2不同提取方法的提取效果研究表明蛹虫草合成的虫草素部分分泌到了培养基中(Masudaetal.2006,2007;文庭池等2010)。因此虫草素的提取原料除了子实体、菌丝体外,还有固体培养的培养基残渣(韦会平等2009;吴勇等2010)、菌皮(钟运俊等2008)等。根据虫草素溶于水、热乙醇和甲醇的性质,虫草素的提取一般采用水、50%乙醇、乙醇和甲醇等溶剂。除直接进行提取外,还可先用乙醚脱脂,再进行提取。提取方法主要有浸提法、回流法、渗漉法、超声法、索氏提取法和超临界萃取法等,不同的提取原料适用的方法不同。多个研究表明对于蛹虫草菌丝体而言,浸提法耗时过长,且提取效果一般,不利于下一步实验的进行;超声波提取法快捷、简便且准确度高,受实验环境、仪器人员条件等因素的限制少,具有较高的提取效率(凌建亚等2002)。黄子琪等(2009)报道微波法要好于超声波提取法,也有报道用微波-超声波协同提取(王陶等2010)。超临界CO2萃取法虽然有较好的效果(陈顺志等2002;Lingetal.2009),但是由于成本过高,需要特殊设备,难以进行大规模应用。对于固体培养基残渣,吴勇等(2010)采用6种不同的提取方法对其中的虫草素进行提取,提取物的收率顺序为:渗漉法>微波法>水热回流法>醇热回流法>超声波水法>超声波醇法。渗漉法提取蛹虫草固体培养基中的虫草素具有提取率相对较高、操作简单、可行性强、不需要较昂贵的仪器,缺点是时间较长;微波法提取则具有提取时间较短的优点。现代提取技术连续逆流提取也用于了培养基残渣中虫草素的提取(韦会平等2009)。总之,虫草素的提取方法针对不同的原材料采用不同的方法,而每种方法都要经过优化得到其最佳工艺,不仅要考虑提取的速率、得率,更重要的是要与后续的纯化方法结合起来,以达到满意的产品纯度和低成本要求。3.3采用吸附、分离的方法生物降解杂草素Cunninghametal.(1951)将蛹虫草菌培养液经过滤后用活性炭吸附,再经过洗脱液洗脱和浓缩,得到虫草素晶体,这种方法工艺简单、成本低,但吸附选择性差、得率低。目前虫草素分离纯化比较常用的方法是离子树脂吸附法、硅胶柱层析法、超临界萃取技术等。离子树脂吸附法的关键在于筛选吸附能力较强及吸附量较多的树脂和优化洗脱方法。目前多用732-NH4+型阳离子交换树脂,但所提取的虫草素较少,提取率较低(车振明2004;毛先兵等2008)。陈星(2001)采用反吸附不交换的方法,即首先调pH使虫草素不被离子树脂吸附,而无关的离子均被离子树脂吸附,除去干扰成分;然后调pH使虫草素被吸附在柱体上,再经洗脱后获得虫草菌素结晶,可得纯度在98%以上的虫草素晶体,并申请了专利。近年来,大孔吸附树脂也用在了虫草素的分离纯化中。吕子明等(2008)用大孔吸附树脂和硅胶色谱柱成功分离鉴定出9种化学成分,包括虫草素;Nietal.(2009)采用DM130大孔吸附树脂,然后用聚酰胺柱层析得到纯度98%以上的虫草素晶体。刘红锦等(2010)考查了7种大孔吸附树脂对虫草素的吸附纯化效果,筛选出适宜的树脂AB-8。此外,硅胶柱层析可以分离与富集虫草素(陈伟等2006)。陈顺志等(2002)采用超临界萃取得到虫草素晶体,纯度为50.0%-99.9%,该技术无污染,易操作,不损害活性天然成分的结构,但所得虫草素的纯度依然不够理想,且成本比较高。4基因水平分析虫草素生物合成涉及多基因的表达和调控,开展并克隆与虫草素生物合成相关基因的研究,有助于从分子水平了解虫草素生物合成的调控机制,为通过基因操作提高虫草素的产量奠定基础。目前,该方面的研究还鲜有报道。莫红丽等(2010)使用诱变剂对蛹虫草菌株进行诱变,筛选虫草素高表达的菌株,在确定该突变稳定可遗传的基础上,采用抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)技术,对虫草素表达产生的差异进行基因水平上的分析,以突变型(高表达虫草素的菌株)作为检测子,以野生型(未作诱变处理的出发菌株)作为驱动子,经过消减杂交后得到一组正调控基因片段的克隆,并对该组克隆进行了序列测定,克隆出7个虫草素生物合成相关的序列,分别命名为chcs1、chcs2、chcs3、chcs4、chcs5、chcs6、chcs7,这些序列均为蛹虫草中首次报道,但是它们的具体功能如何,还有待进一步研究。通过构建含有上述基因的高效植物表达转化载体,增加菌体内生物合成基因拷贝量,以提高虫草菌表达虫草素的含量,并申请了专利(叶小舟等2009)。目前为止在GenBank上还检索不到有关虫草素合成的相关基因。5杂草素衍生物的专利在中华人民共和国国家知识产权局的专利数据库中,以虫草素为关键词检索到74个专利,包括73个发明专利和1个实用新型专利(截止2010年11月18日)。专利内容涵盖了虫草素的提取纯化方法、虫草素产量提高的方法、含有虫草素的产品开发、虫草素合成基因、虫草素衍生物等几个方面(图2),其中关于虫草素的产品开发专利最多,占1/3,涉及虫草素合成基因的专利2个,虫草素衍生物的专利1个。在产品开发方面,均是以蛹虫草子实体或菌丝体为原料的开发,包括了含有虫草素的茶、酒、膨化食品、中药、口香糖、虫草蛋、调味品等,以纯虫草素为原料的产品开发还没有。另外我们将涉及冬虫夏草中虫草素的专利归为了一类,共计10个,占13.69%,因为众多研究已证实冬虫夏草中虫草素不存在或极其微量,显然这类专利值得我们慎重对待。以cordycepin为关键词在欧洲专利局的数据库中共检索到128个专利(截止2010年11月18日),主要来自中国、韩国、日本和美国4个国家,其中中国人申请的专利83个,占64.84%,内容分布和国内专利基本一致,含有虫草素的产品开发较多,其次是蛹虫草的培养方法、提高虫草素产量的方法和虫草素提取纯化方法。日本和韩国人申请的专利分别为21和20个。专利内容体现在虫草素产量的提高、衍生物和产品开发方面。美国人申请的专利4个,均集中在虫草素衍生物的研究方面。国际专利的分布和人们对虫草的认识相关,冬虫夏草在中国历史悠久,可以说是家喻户晓,以冬虫夏草、蛹虫草为原料的保健品、药材在中国及东南亚有着良好的声誉,因此相关研究和产品开发也较多。6目前植物素研究6.1杂草素的商业价值很虫草素具有抗菌、消炎、抗肿瘤、调节人体内分泌和增强人体免疫功能等显著作用,因此无论是在医药还是保健食品方面,虫草素都拥有巨大的开发价值和广阔的市场前景。虫草素疗效显著但大量提取分离得到纯品存在困难,导致国际市场上虫草菌素的价格非常昂贵,目前sigma公司从蛹虫草提取得到的虫草素售价是0.1克6853.86元(SigmaC3394),随着研究的深入,虫草素的商业价值更是不可估量。我国东北、江苏、浙江等有关科研院所也从蛹虫草中提取到了虫草素样品,但至今全球仍未见有任何国内外科研院所和工厂企业能够真正实现工厂化批量提取生产的报道,也就是说目前全世界还未能实现虫草素生物合成的产业化。目前提取虫草素的主要原料为蛹虫草,不论是人工栽培子实体还是液体发酵菌丝体都已经实现了产业化,虫草素的药理药效和作用机制越来越明了,其开发利用具有良好的市场前景。6.2菌株诱变及微生物来源检测在目前通过基因工程生产虫草素还不现实的情况下,从种质资源入手应该是一个很好的思路。一方面,通过各种诱变手段对蛹虫草菌株进行诱变,筛选虫草素产量高的菌株,克服菌株退化;另一方面,研究探索虫草素新的微生物来源。虽然有报道无冠构巢曲霉及一些其他种的虫生真菌也能产生虫草素,但对于其菌株诱变筛选、培养条件优化等进一步研究还不够。寻找生长速度较快且产虫草素能力强的其他菌株,将可能成为虫草素的另一个重要生物源。6.3采用高效的提取工艺目前国内外对虫草素分离纯化工艺进行了积极的研究,并取得了一定的进展。但是,现有的方法都不同程度地存在着提取率低