植物染色质结合蛋白和dna的时空结合关系研究

植物染色质结合蛋白和dna的时空结合关系研究

水体的dna不是唯一一个单独分离的。它的稳定和功能取决于蛋白质结合形成的综合体的结合。DNA结合蛋白包括组蛋白、转录因子和其他染色质结合蛋白。大约165个碱基对的DNA缠绕在H2A、H2B、H3和H4组成的组蛋白八聚体上,构成染色质的基本单元核小体。核小体长链经过复杂的折叠形成了具有高度螺旋化结构的染色质。DNA埋藏在这个高度紧缩的染色质结构中稳定存在。生物体感受细胞外信号,快速进行一系列的生化反应,如基因转录、基因活化、DNA复制和DNA修复。这些生理生化过程中染色质不断通过结构的动态变化解螺旋,释放出的DNA双链与不同的蛋白或蛋白复合体结合,在这些蛋白的协同作用下完成生物体的各种调控。研究表明,DNA与组蛋白的结合关系对染色质结构的动态变化有重要作用,功能蛋白或蛋白复合体与DNA特异区域的结合直接调控了基因的表达,例如:RNApolymeraseII与基因的启动子区域结合,启动了基因的转录过程;DRM2识别重复序列的DNA,并与其结合使胸腺嘧啶甲基化,沉默了该基因。环境因子、发育信号等如何调控基因的转录是当前分子生物学研究的热点。这些研究都需要分析参与基因表达调控的DNA元件和特异性结合的蛋白质因子。因此,研究DNA与蛋白之间的结合关系对探索复杂的生命活动有重要意义。目前报道的DNA与蛋白结合关系的研究方法主要有:根据裸露的DNA和DNA-蛋白复合体在电场中迁移率的不同而设计的凝胶阻滞检测方法;根据DNA-蛋白复合体中DNA受保护而不被DNaseI切割原理设计的DNA足迹检测方法;硫酸二甲酯特异甲基化修饰裸露DNA的鸟嘌呤,六氢吡啶识别并切割这种修饰位点,依据这个原理设计的DNA甲基化干扰试验方法。这3种方法有一个共同的不足之处———均为体外检测方法,考虑到这些试验结果是否能反映生物体内真实的生命过程,分子生物学家依据抗原抗体的特异结合原理,设计了染色质免疫共沉淀试验方法,即在染色质环境下研究染色质结合蛋白与DNA之间相互关系的技术。拟南芥(Arabidopsisthaliana)CpG甲基化的维持依赖DNA甲基转移酶1(MET1),在突变体met1中CpG甲基化大量减少,有研究表明,异染色质区转座子At4g03870的组蛋白H3第9位赖氨酸的甲基化与CpG甲基化互相依赖,Tariq等通过染色质免疫共沉淀的方法研究了野生型Col-0和突变体met1中组蛋白H3第9位赖氨酸甲基化的差异。本研究将以拟南芥野生型Col-0和突变体met1为研究对象,重复Tariq等的试验结果,并且结合已报道的技术资料,修改并完善了试验方法,从6个方面详细描述试验步骤(图1),并为单个基因与蛋白结合关系的研究和特异蛋白结合位点的全基因组学研究推荐方法,供分子生物学研究者交流使用。1材料和方法1.1植物材料将在土中生长3周的拟南芥野生型Col-0和突变体met1的幼嫩叶片在液氮中收集冻存,待用。1.2领导人的测定、蛋白质和dna的结合1.2.1准备考试前的准备工作1.2.2样品的制备和分离液氮提核:每个样品取0.5g植物材料于液氮中充分研磨,倒入有8mL提核缓冲液M1的15mL离心管中,快速上下颠倒数次混匀。本试验共分两组,第1组,4个野生型Col-0,用于检测适宜的超声条件;第2组,一个野生型Col-0和突变体met1,用于免疫共沉淀试验。蛋白和DNA的甲醛交联:在上述已混匀的样品中均加入216μL37%的甲醛(终浓度为1%),置于4℃冷室缓慢摇晃孵育10min。中和甲醛,终止交联:每个已交联的样品中加入543μL2mol·L-1的甘氨酸(终浓度为0.125mol·L-1),置于4℃冷室摇晃孵育5min。除去未研磨充分的植物残渣:在漏斗中铺设4层滤膜,过滤上述溶液到新标记的15mL离心管中。分离得到细胞核:12000r·min-1,4℃,离心10min,弃上清液。12000r·min-1离心时细胞核因为比重较大会沉淀,而其他的植物组织位于上清液中,弃上清可以得到相对纯净的细胞核。清洗细胞核:用冰浴的1mLM2缓冲液吹吸混匀沉淀,转入1个1.5mL离心管中,13200r·min-1,4℃,离心1min,弃上清洗细胞核。再用1mL的M2缓冲液吹吸清洗,离心,弃上清,重复两次。最后一次离心后小心地除去所有的上清,沉淀用1mLM3缓冲液吹吸混匀。至此得到大量完整相对干净,蛋白和DNA交联的细胞核。1.3超声破碎1.3.1准备考试前的准备工作1.3.2超声效率的检测细胞核膜裂解:将溶解于M3缓冲液中的细胞核,13200r·min-1离心1min,去上清,每个样品用300μL核裂解和超声缓冲液吹吸混匀细胞核颗粒。细胞核裂解和超声缓冲液中1%的SDS会将细胞核膜裂解,至此染色质完全暴露。超声打断染色质:超声波打断染色质,是染色质免疫共沉淀试验的关键步骤,染色质片段过大会严重降低共沉淀效率,而过小的片段使PCR难于检测。由于不同的超声波破碎仪,功率完全不同,因此初次试验必须做超声功率,超声时间和超声次数的梯度试验。本试验使用的是新芝JY92-IIN型超声破粉碎机。第1组4个野生型Col-0用于检测超声效率。每个野生型取出10μL混合,作为超声前基因组对照,每个野生型再分别取出10μL作为上样量对照,将两个野生型Col已裂解的细胞核分别用12%和15%功率超声5s,置于冰上间隔20s,共超声11次。为保证检测的超声条件稳定,另外两个野生型Col已裂解的细胞核同样功率重复超声一次。将超声样品和超声前基因组对照,上样量对照一起用1%的琼脂糖凝胶电泳检测超声效率。在适宜的超声条件下,将第2组一个野生型Col-0和突变体met1,进行超声。获得打断的染色质:将第2组的超声溶液13200r·min-1、4℃离心5min。上清为打断的染色质,沉淀为植物组织破碎的杂质,取上清。取对照标准:在染色质免疫共沉淀试验中,对照标准起内参作用,蛋白结合的DNA量是根据占总DNA含量的百分比来相对定量。每个样品取10μL作为总DNA对照,标记Col-input,met1-input放置于-20℃待用。1.4抗感染的结合反应1.4.1准备考试前的准备工作1.4.2proinaagaruse-met1-no生物不良反应检测稀释样品:将上述含有细胞核裂解液的染色质溶液用CHIP缓冲液稀释至3mL待用。清洗ProteinAAgarousebeads:为防止beads受损,每个样品用去尖端的枪头吸取120μLproteinAAgarousebeads分装入两个1.5mL的离心管中,分别用1mLCHIP缓冲液清洗,2000r·min-1离心,去上清,重复清洗3次。将上述待用的3mL溶液,加入已清洗的ProteinAAgarousebeads管中,每管1.5mL,一管标记抗体,另一管标记非抗体。例如,本试验标记Col-antibody,Col-noanti-body;met1-antibody,met1-noantibody。预处理:将含有ProteinAAgarousebeads的染色质溶液在4℃冷室缓慢摇晃孵育1h,把染色质溶液中可以结合ProteinAAgarousebeads的物质去除,防止非特异性结合,提高试验的准确性和可重复性,类似westernblot和northernblot的预杂。10000r·min-1,4℃,离心2min,取上清。抗原抗体结合反应:每个样品,在抗体管加入10μLanti-H3K9Me抗体,另一管非抗体管不加抗体。所有的样品同时置于4℃冷室,缓慢摇晃孵育过夜。在孵育过程中,抗体会特异结合到抗原蛋白上,抗原蛋白交联着目的DNA片段,用来研究蛋白和DNA之间的结合关系。1.5共染色免疫沉淀1.5.1准备考试前的准备工作1.5.2大、中、细共沉淀:每个处理加入75μL用CHIP缓冲液清洗的proteinAAgarousebeads,在4℃冷室缓慢摇晃孵育1h。这时proteinAAgarousebeads会特异结合抗体。2000r·min-1、4℃离心1min,离心使beads结合的抗体,抗原蛋白和交联的DNA一起沉淀,弃上清,保留beads。去除非特异性结合:1)低盐缓冲液清洗,用低盐缓冲液清洗beads两次,第1次每管加入1mL缓冲液,缓慢摇晃混匀,立即在4℃2000r·min-1离心1min,弃上清;第2次每管加入1mL缓冲液,缓慢摇晃混匀5min,4℃2000r·min-1离心1min,弃上清。2)高盐缓冲液清洗,两次清洗方法同低盐缓冲液。3)氯化锂缓冲液清洗:两次清洗方法同低盐缓冲液。4)TE缓冲液清洗:两次清洗方法同低盐缓冲液。解交联:加入250μL新配置的Elution缓冲液,摇晃混匀,65℃15min2000r·min-1离心1min,小心地将上清转入新的1.5mL离心管中,重复一次,获得约500μL蛋白和交联的DNA溶液。此时,蛋白质和其交联的DNA,溶解于Elution缓冲液中。从-20℃取出待用的10μL参照标准,用Elution缓冲液补体积至500μL,同时与样品解交联。在所有处理溶液中加入20μL5mol·L-1氯化钠溶液,65℃静置6~8h,交联的蛋白和DNA将解交联。1.6纯度dna1.6.1准备考试前的准备工作1.6.2残留rna的rnasea消化蛋白和RNA:在解交联的溶液中加入31.5μL蛋白消化液,45℃静置孵育1h。然后每管加入10μL2μg·μL-1的RNaseA,室温孵育30min消化体系中残留的RNA。纯化DNA:每管加入2.5mLPB缓冲液和50μL3mol·L-1乙酸钠,乙酸钠用于帮助沉淀DNA,PB缓冲液将DNA结合到柱子上,按Qiagenspinminiprep试剂盒说明纯化DNA,100μLEB缓冲液溶解DNA。1.7测试1.7.1准备考试前的准备工作1.7.2pcr检测染色基因组阳性对照,Col-noantibody和met1-noanti-body作为阴性对照,Col-antibody和met1-antibod-y为样品。按20μL半定量PCR体系(10×PCRbuffer2μL,dNTP1μL,正向引物0.2μL,反向引物0.2μL,DNA1μL,Taq酶0.25μL,ddH2O至20μL)加样,做半定量PCR,然后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。正向引物和反向引物可以设计在蛋白与基因组结合的任意位点。本试验参照Tariq等的研究,选择正向引物Actin2/7F:ATGGAATCCATCGC-CAGCTTCAC,反向引物Actin2/7R:CGCGAGG-TAGATCGATACATTCC来检测染色质免疫共沉淀效率。选择正向引物At4g03870F:ATGAAGG-GAGCTTCGATAGAGGAGG,反向引物At4g03870R:TAGACTCTTCATCCCCGTCACTCGC来检测使用本研究提出的染色质免疫共沉淀方法是否能得到与已报道的结果趋势相同。1.8col-/met1-对抗投料回复突变体的检测对于蛋白和目的基因之间结合关系的研究,可以通过real-timePCR来相对定量分析。Col-input和met1-input为基因组阳性对照,Col-noantibody和met1-noantibody作为阴性对照,Col-antibody和met1-antibody样品之间相互比较分析差异。采用ABIPrism7500定量PCR仪和TransStartGreenqPCRSuperMix试剂盒,定量分析比较了野生型Col和突变体met1中转座子At4g03870H3K9甲基化的差异,得到了与Tariq等趋势相同的结果。针对不同的Real-timePCR仪,应使用对应的qPCR试剂盒,例如BioRadCFX96,一般推荐使用SYBRGreenERSupermix,ABIPrism7500和TransStartGreenqPCRSuperMix。PCR程序和体系,参照qPCR试剂盒的说明。1.9全基因组研究蛋白质结合DNA的全基因组研究。通过染色质免疫共沉淀技术构建的全基因组文库,来研究蛋白质-基因组的特异性结合,已广泛应用于动植物基因调控和蛋白质功能学研究,这一技术对遗传发育与表观遗传具有很重要的意义。当前已经有大量的文献报道了染色质免疫共沉淀的全基因组文库构建和分析的方法。本研究推荐使用illu-mina商品化的PreparingSamplesforCHIPSe-quencingofDNA试剂盒构建全基因组文库,采用Volouev等报道的方法进行数据分析。2结果与分析2.1超声产物的扩增染色体的超声产物对染色质免疫共沉淀是非常重要的(图1),产物片段太小不利于定量分析时引物的设计,太大则影响免疫共沉淀并造成定量分析时大量的假阳性。研究表明超声产物的片段以200~800bp为宜。本研究用新芝JY92-IIN型超声破粉碎机12%和15%功率,对野生型Col-0分别超声11次,检测适宜的超声条件。图2中A为超声前基因组,DNA>10kb,说明超声前作为对照的基因组是完整的;图2中B为15%功率超声11次后的产物,E为它的生物学重复;C为12%功率超声11次后的超声产物,D为它的生物学重复;b、c、d和e分别为对应B、C、D和E的上样量对照。本研究结果表明,12%功率超声11次后,超声产物大部分处于300~500bp(图2);15%功率超声11次后,虽然超声产物在300~500bp出现了明显的条带,但相对于12%功率产物,表现为过超声状况,即超声产物没有在200~800bp大量出现。相同的上样量对照说明4个野生型Col-0的超声前产物中基因组DNA的含量是均等的,15%功率超声后产物和12%相比(图2),发现在过超声条件下过小的超声片段在电泳中以极快的速度迁移出琼脂糖凝胶,从而获得较少的适宜产物,这样的产物会影响定量分析。研究表明,新芝JY92-IIN型超声破粉碎机,12%功率超声11次后,超声产物达到了染色质免疫共沉淀的要求,并且生物学重复稳定可靠。建议染色质免疫共沉淀研究者,初次试验时必须参照超声破粉碎机的说明,摸索超声功率,超声时间和超声次数的条件,以便超声产物达到染色质免疫共沉淀的要求。2.2pcr扩增效果经过5个部分的连续操作,第2组材料最终获得了与蛋白结合的DNA片段。如何检测染色质免疫共沉淀试验是否成功,结合大量的报道,本研究提出了低成本的半定量RCR检测方法。其检测结果表明,阳性对照Col-input和met1-input均出现明显条带,这说明半定量PCR系统工作良好,没有出现引物二聚体,说明引物设计完美(用实时定量PCR对比分析结果时引物二聚体的扩增会干扰试验结果)。样品条带(图3Col-antibody和met1-antibod-y)与阴性对照(图3Col-noantibody和met1-noan-tibody)差异明显,说明抗体起到免疫共沉淀作用,体系无污染。Col-antibody和met1-antibody的差异表明,在突变体met1中anti-H3K9Me抗体结合的DNA量大大减少,即异染色质区转座子At4g03870的组蛋白H3第9位赖氨酸的甲基化显著减少,试验结果与Tariq等的报道一致,通过定量PCR所得的结果与Tariq等的报道趋势一致(图4),说明本研究提出的染色质免疫共沉淀试验方法是可行的。成功的免疫共沉淀产物可用来做更多目的基因的定量分析和蛋白质结合DNA的全基因组研究。3半定量pcr法检测染色质免疫共沉淀植物的生长发育和对外界环境的适应,都依赖相关基因的时空调控,蛋白质无疑在这一调控过程中起主要作用。蛋白质对基因的调控需要与染色质结合,然后启动或关闭基因的转录。研究蛋白质和DNA的相互关系是从机制上研究基因调控的手段。染色质免疫共沉淀正是在体内研究染色质结合蛋白质DNA的有效方法,本研究提出的试验方法不仅可用来做目的基因的定量分析,而且适用于构建特异蛋白的全基因组结合图谱。Bowler等用1.5g拟南芥材料起始,利用先交联再提核的方法获得细胞核,本研究参照Park等的液氮提核方法,修改简化了试验步骤,提出了先提核再交联的方法,提高了提核效率,将初始材料减少至0.5g,方便珍贵植物材料的研究。甲醛广泛应用于体内交联蛋白质与DNA、蛋白质与蛋白质,本研究参照Orlando和Paro及Kuo和Allis提供的甲醛共价交联方法,交联牢固又方便廉价,而不是部分研究使用的UV交联,避免了整个植物组织交联不充分的缺点。对影响染色质免疫共沉淀最重要的超声破碎部分做了详细地说明,为科研工作者提供了方法和建议,避免因超声产物不合格而浪费昂贵的抗体。研究表明,盐浓度对蛋白质和DNA的结合非常重要,梯度盐溶液清洗,能够洗脱非特异性结合。TE缓冲液用于清洗和中和体系中大量的高浓度盐离子。参照Bowler的方法,同一清洗缓冲液,本研究进行了两次不同的清洗,以充分去除非特异性结合。本研究提出的半定量PCR法检测染色质免疫共沉淀试验,可以直接从胶图结果看到体系中抗体是否起到免疫共沉淀作用,体系有无污染,而不用通过实时定量PCR来分析。用拟南芥野生型Col-0和突变体met1,H3K9Me抗体得到的染色质免疫共沉淀产物,半定量检测表明染色质免疫共沉淀试验成功,定量试验与已报道的结果趋势一致,这说明本研究提出的试验方法稳定可行。配置37%甲醛,2mol·L-1甘氨酸,蛋白酶抑制剂cocktail(1∶500去离子水稀释),每个样品8mL提核缓冲液M1(10mmol·L-1phosphatebuffer,pH7.2,0.1mmol·L-1NaCl,10mmol·L-1mercapto-ethanol,1mol·L-1hexyleneglycol,1∶100加入稀释好的蛋白酶抑制剂),每个样品3mL提核缓冲液M2(10mmol·L-1phosphatebuffer,pH7.2,0.1mmol·L-1NaCl,10mmol·L-1mercapto-ethanol,1mol·L-1hexyleneglycol,10mmol·L-1MgCl2,0.5%Triton-X100,1∶100加入稀释好的蛋白酶抑制剂),每个样品1mL提核缓冲液M3(10mmol·L-1phosphatebuffer,pH7.2,0.1mol·L-1NaCl,10mmol·L-1mercapto-ethanol,1∶100加入稀释好的蛋白酶抑制剂);预冷离心机至4℃,所有操作都应于冷室或冰上进行,防止蛋白降解。配置核裂解和超声缓冲液(50mmol·L-1Tris-HC