大剂量阿托品联合注射大剂量阿托品对过量肾上腺素致小鼠肺水肿的影响

大剂量阿托品联合注射大剂量阿托品对过量肾上腺素致小鼠肺水肿的影响

急性肺水肿是由多种有害因素引起的一种严重急性疾病。病理生理的一般变化是增加肺毛细血管壁渗透性和增加内压，导致肺和肺水肿。肾上腺素过量所致的实验动物急性肺水肿症状典型,已成为研究肺损伤的常用模型,但其机制尚未完全明确。α受体阻断剂酚妥拉明对该肺水肿具有一定的拮抗效果,提示α受体过度兴奋在肺水肿发生中可能起重要作用,但过量肾上腺素对心脏的影响及其与急性肺水肿间的关系仍未明确。本研究通过建立过量肾上腺素所致小鼠急性肺水肿模型,旨在探讨药物对α、β受体及对心脏的影响,以进一步阐明肾上腺素引起小鼠急性肺水肿的机制。1材料和方法1.1动物和小组健康ICR小鼠,体质量(21±3)g,雌雄各半,由苏州大学实验动物中心提供。各次实验均随机分组,各组样本数见“结果”部分。1.2药物、试剂和仪器盐酸肾上腺素(adrenaline,Ad)注射液(上海禾丰制药有限公司,批号090904),盐酸普奈落尔(propranolol,Pro)为Sigma公司产品(产品号141558054708234),酒石酸美托洛尔(metoprolol,Me)为江苏天禾药物有限公司产品(批号200904011),重酒石酸去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)注射液为武汉诺佳药业集团股份有限公司产品(批号090105),甲磺酸酚妥拉明(phentolamine,Ph)注射液为上海旭东海普药业有限公司产品(批号090502),硫酸阿托品(atropine,Atro)注射液为南京金陵制药厂产品(批号081001)。不同浓度的试剂均于临用前以生理盐水(normalsaline,NS)配制。1.3方法1.3.1普尼菲尔的小鼠与美托洛尔、ad和me3对小鼠的药代动力学1.实验Ⅰ:生理盐水组小鼠以0.2ml/10g体质量的量经腹腔注射生理盐水;其余各组小鼠均按文献方法先以0.1ml/10g体质量的量经腹腔注射浓度为1mg/ml的肾上腺素,然后迅速注入等量相应的试验药液:肾上腺素组给予等量生理盐水,酚妥拉明组给予0.1mg/ml的酚妥拉明,不同剂量美托洛尔组(Me1、Me2、Me3)分别给予0.8、0.2、0.05mg/ml的美托洛尔;去甲肾上腺素组先以0.1ml/10g给予0.15mg/ml的去甲肾上腺素后再给予等量生理盐水。实验Ⅱ:同实验Ⅰ方法处理生理盐水组和肾上腺素组小鼠。不同剂量普萘洛尔组同实验Ⅰ注射肾上腺素后再分别以0.1ml/10g的量立即经腹腔注射0.05、0.1、0.2、0.4mg/ml、0.8mg/ml的普萘洛尔(即Pro1、Pro2、Pro3、Pro4和Pro5组)。实验Ⅲ:按0.1ml/10g体质量计算小鼠药物的注射剂量,将小鼠分成4组:肾上腺素(1mg/ml)与生理盐水组(Ad+Ns组)、肾上腺素(1mg/ml)与阿托品(0.26mg/ml)组(Ad+Atro组)、肾上腺素(1mg/ml)与普奈落尔(0.4mg/ml)组(Ad+Pro组)、肾上腺素(1mg/ml)与美托洛尔(0.4mg/ml)组(Ad+Me组)。实验Ⅳ:取2只小鼠按0.1ml/10g体质量的量经腹腔注射1mg/ml的肾上腺素,另取2只注射等量生理盐水作为对照。1.3.2肺组织病理切片观察。据载观察注射药物前后小鼠大体情况变化并记录存活时间,30min后仍未死亡则以颈椎脱臼法处死,并标记为存活。小鼠死亡后(因肺水肿死亡或处死),剖开颈部及胸腔,用线扎住气管下端完整地取下肺,称肺质量,计算肺系数:肺系数=肺质量(mg)/体质量(g),并观察肺的颜色和形态。将称重后的肺组织留取右叶并按分组放入10%甲醛溶液中固定,常规方法制作肺组织病理切片,HE染色,在光学显微镜下观察肺组织的病理改变。实验Ⅲ:观察小鼠心电图。采用南京美易公司的Medlab6.1版生物信号采集处理系统在第四通道上对小鼠心电图Ⅱ导联信号的采集与处理(信号采集时仪器参数设置为放大倍数2000、上限100Hz、时间常数2ms及50Hz陷波关)。观察和记录用药前和给药后1～5min时间段的心率和波形的变化。实验Ⅳ:观察小鼠心肌组织超微结构。取腹腔注射肾上腺素(实验对照鼠注射等量生理盐水)2min后急性中毒死亡(对照鼠则脱臼处死)的小鼠,立即开胸取心脏,切取1mm×1mm×2mm心肌组织块,用4%冷戊二醛溶液固定,常规方法进行透射电镜标本处理及形态观察。1.4心率比较方法运用SAS8.0统计软件包,计量数据以ˉx±s表示,采用随机分组方差齐性检验后的单因素方差分析统计多组间的显著性差异。两用药组间心率比较采用方差齐性检验后的t检验,用药前后不同时间组间心率两两比较采用方差齐性检验后的单因素方差分析。对用药后两组各小鼠出现心律失常直到完全恢复正常节律过程进行观察,对异常心律发生的次数根据该节律发生时前后的正常节律判定并记录,采用两样本非参数统计等级和检验法(Wilcoxon,MannandWhitney法)进行组间比较。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1不同浓度组美托洛尔组表现为生理盐水组小鼠肺形态无明显变化。酚妥拉明组呈局部或点状淤血。肾上腺素组和普奈洛尔组小鼠肺明显肿大、饱满,呈暗红色,淤血,有点状或片状出血,气管内可见泡沫样液体,肺切面有粉红色泡沫样液体溢出。美托洛尔组表现为肺肿大、饱满、淤血,有点状或片状暗红色出血,气管内可见泡沫样液体,肺切面有粉红色泡沫样液体溢出。不同浓度组间表现无明显差别。去甲肾上腺素组小鼠肺肿大淤血,气管内可见泡沫样液体,肺切面有粉红色泡沫样液体溢出。2.2小鼠肺系数n实验Ⅰ:生理盐水组的肺系数最小,为12.086±2.457(n=20),并明显低于肾上腺素组(20.319±4.426,n=24)和各浓度的美托洛尔组(Me1组为17.752±2.823,n=26;Me2组为19.032±5.167,n=30;Me3组为19.594±4.483,n=25),差异均有统计学意义(均P<0.05);酚妥拉明组的肺系数为14.617±5.053(n=19),虽高于生理盐水组,但差异无统计学意义(P>0.05),但也明显低于肾上腺素组和美托洛尔组(均P<0.05);美托洛尔各组小鼠肺系数与肾上腺素组相比,差异无统计学意义(P>0.05),去甲肾上腺素组肺系数(17.985±7.076,n=13)则明显高于生理盐水组(P<0.05)。实验Ⅱ:肾上腺素组肺系数(20.346±2.766,n=11)和5个浓度的普奈洛尔组的肺系数(分别为15.407±5.072、17.141±4.931、16.521±4.875、17.386±5.617和17.414±5.617,均n=10)高于生理盐水组(12.086±2.457,n=11),差异均有统计学意义(均P<0.05)。各浓度普奈洛尔组的肺系数虽略低于肾上腺素组,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.3小鼠肺水肿程度生理盐水组:肺组织结构正常,肺泡结构完整,肺泡腔内及间质无出血及渗出(图1A)。肾上腺素组:肺泡壁毛细血管扩张,充满大量红细胞,肺泡壁显著增厚,少数肺泡腔内及细支气管内充满均质红染的浆液和数量不等的红细胞(图1B)。酚妥拉明组:部分肺泡淤血、含红染液体,肺泡内无红细胞漏出,肺泡壁增厚不明显,细支气管内可见水肿液及红细胞渗出,肺水肿程度较肾上腺素组轻微(图1C)。普奈洛尔组:大部分肺泡内充满均质红染的水肿液和较多红细胞,肺泡壁毛细血管扩张充血,呈明显的肺淤血状态,肺间质及肺泡壁明显增厚,呈肺水肿状态(图1D)。美托洛尔组:肺泡内有均质红染的水肿液和较多红细胞,肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡壁增厚,总体与肾上腺素组小鼠肺水肿程度无显著差异(图1D)。去甲肾上腺素组:部分肺泡淤血、含红染液体,有较多红细胞,肺泡壁毛细血管扩张,肺泡壁显著增厚,与肾上腺素组小鼠肺水肿程度无显著差异(图1E)。结果表明:过量肾上腺素可引起小鼠肺水肿,迅速给予普萘洛尔或美托洛尔不能阻止过量肾上腺素致肺水肿;酚妥拉明可部分减轻肾上腺素所致的水肿程度;大剂量去甲肾上腺素亦能导致小鼠肺水肿。2.4普托洛尔和美托洛尔心率比较过量肾上腺素对小鼠心率和节律的影响见表1、2和图2、3。由图2可见,肾上腺素加阿托品组在给药后3～4min心率明显高于肾上腺素加NS组,且心律失常发生的频率也明显低于后者(均P<0.01),而加注普萘洛尔或美托洛尔组心率趋于更低,心律失常更重(表1、2)。由表1和图3可见,过量肾上腺素可使心率减慢,引起心律不齐、各种类型窦房或房室传导阻滞、窦性停搏伴交界性逸搏等异常节律。2.5过度使用添加剂会影响大鼠的心肌超微结构采用透射电镜观察,与注射等量生理盐水对照小鼠相比,心肌细胞未见显著超微结构方面的异常改变(图4)。3不同剂量受体阻断剂对小鼠肺水肿的影响有学者认为,肾上腺素对α和β受体都有激动作用,可使血压及肺动脉压急剧升高,心肌收缩力加强,心率加快,心肌耗氧量增加,使皮肤、黏膜及内脏小血管收缩,导致体循环血管和肺血管剧烈收缩,使心脏后负荷明显增加,打破了Starlling定律平衡而引起动力性肺水肿。陈宁等通过对肾上腺素对家兔作用的研究发现,给予中毒剂量的肾上腺素后,家兔并未出现心率加快的现象,因而认为肾上腺素导致肺水肿的机制仍主要在于其对血管的作用。然而,迄今的文献大多没有给出进一步的证据来说明过量肾上腺素致肺水肿的详细机制。我们首次报道使用一定剂量α受体阻滞剂酚妥拉明可拮抗过量肾上腺素所致小鼠肺水肿,从而初步证明α受体的强烈兴奋在过量肾上腺素所致小鼠肺水肿的主要机制,但尚未能证明肾上腺素对β受体的作用是否参与肺水肿的形成。本研究在以大剂量肾上腺素复制急性肺水肿模型的同时,通过给予小鼠不同的β受体阻断剂来观察β受体的兴奋在肺水肿形成中的作用。实验中所使用的普萘洛尔为广谱β受体阻断药,对β1和β2受体均有阻断作用。阻断β1受体应可使心率减慢,心肌收缩力和心排出量降低,血压稍下降;阻断β2受体,可引起骨骼肌血管收缩,加之心功能抑制,心排出量降低,可使外周阻力增加。在给予肾上腺素再注入普萘洛尔后观察,不同剂量普萘洛尔组的肺系数与模型组比较,虽有下降趋势但未见有统计学意义的区别,显然α受体占优势的皮肤、黏膜及内脏血管仍呈显著收缩反应;而普萘洛尔对β2受体的阻断作用可能还促使骨骼肌血管收缩,最终促使体循环压力仍急剧升高。肺水肿的发生可能与肺毛细血管上α受体密度较低,血管相对舒张,肺循环内的压力相对较低有关。大量体循环的血液转入肺循环的程度加大,加重肺淤血、水肿。实验中使用的美托洛尔为β1受体阻滞剂,但对过量肾上腺素所致小鼠肺水肿的肺部病变程度总的影响不大,也说明β1受体的激动并非肾上腺素致小鼠肺水肿的主要原因。从使用两种β受体阻断剂的效果来看,并未见到有特别明显的效应上的差异,即仅阻断β1而保留β2受体兴奋(舒张骨骼肌血管),也不能明显改善肺水肿。结果可表明,肾上腺素对β1受体的兴奋作用不是导致急性肺水肿的主要原因。有文献报道,使用超短效β1受体阻断剂兰地洛尔能明显改善心肺复苏术中应用肾上腺素(0.02mg/kg体质量)所致SD大鼠的肺水肿,对给药后2h实验和对照两个组中存活下来的大鼠作对比观察,给予兰地洛尔组的肺湿/干重比值显著低于仅给肾上腺素的对照组,但两组在血气分析指标及存活时间等方面并未表现出显著的差异。本研究中给予小鼠不同剂量β1受体阻断剂美托洛尔均却未见到肺系数的显著下降(虽大剂量组有所下降),结果与该文不一致主要可能与给予肾上腺素的剂量不同等有关。本实验观察到,即使不用β受体阻滞剂,注入过量肾上腺素的间接作用本身就迅即引起心率减慢而非加快,这支持了陈宁等在家兔实验中所观察的结果。本研究还表明,过量肾上腺素联合用较大剂量β受体阻滞剂反而可加重心律失常,并趋于使心率更慢从而可能加重小鼠体内的病理过程;阿托品有助于拮抗这种心律失常,提示当过量肾上腺素使外周阻力突然升高时,可能使迷走神经反射性兴奋,从而对心脏起抑制作用,这也得到文献观点的支持。阿托品是否可能拮抗过量肾上腺素所引起的小鼠急性肺水肿,根据我们新近初步观察的结果,在本实验剂量条件下,阿托品可能仅起到兴奋心脏的效应,但并不改变肺循环的高压状态,因而尚难明显改变中毒小鼠的生存时间和肺系数。本研究对给药前后小鼠进行心电图的动态观察,明确了过量肾上腺素对心脏活动带来的抑制效应。此结果较少见到文献报道。酚妥拉明作为α受体阻滞剂,可有效拮抗肾上腺素过量性肺水肿,同时(根据我们新近初步观察的结果)还可起到与阿托品相似的拮抗过量肾上腺素引发的心律失常作用,而直接用去甲肾上腺素也能建立小鼠的肺水