rna干扰与植物基因功能

rna干扰与植物基因功能

2006年10月2日，瑞典皇家卡罗琳医学院的诺格尔举行了这次诺格尔医学奖，由美国马萨朱塞尔医院的克雷格梅洛教授和纽约大学医学院的约翰莫里斯教授分享，并赞扬发现虚假干扰的贡献。RNA干扰是指外源或内源性的双链RNA进入细胞后引起与其同源的RNA特异性降解,从而抑制相应基因表达,表现出特定基因缺失的现象,它与植物中的共抑制(co-suppression)或转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)、真菌中的基因阻抑(quelling)一样,均是生物体内普遍存在的一种生理机制。RNA干扰现象普遍存在于动植物中。在过去的20年,RNA干扰作为沉默基因表达的本能机制而出现,这种古老的抗病毒反应可以用来特定地抑制某种目的基因功能,RNA干扰正在成为一个非常有效的研究工具用于揭示许多基因的功能。目前,有关RNA干扰机理尚未阐明,相关的研究主要集中在治疗人类疾病和提高植物的性状方面。通过调查研究新秀杆线虫(Caenorhabditiselegans)、果蝇(Drosophilamelanogaster)及许多的无脊椎动物、植物[如拟南芥(Arabidopsisthaliana)]、真菌[如粗糙链孢霉(Neurosporacrassa),但不包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)]、老鼠胎儿期干细胞、卵母细胞及早期的胚胎等,发现了通过提供与所要沉默的基因序列一致的双链RNA(dsRNA)可以从中中断任何基因的表达。1srna在基因组的位点上诱导dna甲基化查尔酮合成酶基因CHS(chalconesynthase)与花色的关系密切,基因表达量的增加或减少都可能导致花色产生变异。1990年,Napoli等尝试在有颜色的矮牵牛(Petuniahybrida)花翼瓣中通过介入CHS基因使查尔酮合成酶过量表达,来加深花瓣的颜色。出人意料的是,花瓣颜色不仅未加深,而且42%的介入CHS基因的植物的花全部变白或有白色或灰白图案。当时他们称之为基因的共抑(co-suppression),并认为这种现象与甲基化作用(methylation)有关。在植物中,dsRNA可以在基因组的同源序列位点上诱导DNA发生甲基化。甲基化是不对称的,且不仅限于cpG或cpxpG序列,若甲基化发生在编码区,对该基因座的基因转录无显著影响,但是会引起转录后基因沉默;若发生在启动子区,则诱发转录水平基因沉默(transcriptionalgenesilencing,TGS),它与PTGS不同,具有稳定和可遗传的特点。1991年,Fire等把RNA注入新秀杆线虫以控制基因的表达。1992年,Romano和Macino在粗糙链孢霉中发现外源基因的导入可以抑制具有同源序列的内源基因的表达,称之为基因表达的阻抑作用。1995年,美国康奈尔大学的Guo和Kemphues试图利用反义RNA技术阻断线虫par-1基因的表达,出现了par-1基因关闭的现象。Waterhouse等发现,在植物中双链RNA分子能诱导PTGS的现象,证明在被病毒感染后,能同时产生与病毒基因组同源的正义和反义RNAs的植物比那些只能产生正义或反义RNA的植物能更有效地抵御病毒的入侵。在特定的生物学系统中把RNA导入到细胞中可以阻止内在基因功能的表达。1998年,美国华盛顿卡耐基研究院的Fire等在研究RNA干扰所需的结构和传递条件的试验中发现,把dsRNA正义链和反义链的混合物注入线虫体内,比注入单独的任意一个正义链或反义链的效果均要好;把纯化的正义或反义链注入成年动物体内效果较弱,然而双链的混合物则产生强有力的、特定的干扰,这种干扰的效应不仅存在于被注入dsRNA的动物,在后代中同样有效。实际上,每个受感染的细胞只需要很少分子的dsRNA便能引起足够的效应来干扰内在同源基因(endogenousmRNA)的表达,并认为在干扰的进程中存在催化或放大作用,他们将这种现象命名为RNAi。2干扰过程2.1干扰特征2.1.1干扰作用及作用RNAi具有很高的特异性,只降解与其序列相应的单个内源基因的mRNA,而对不相关序列的表达无干扰作用。不同目的基因结构序列合成的dsRNA产生的效应存在显著差异,外显子序列的dsRNA能产生特异和高效的基因抑制,而只针对内含子序列的dsRNA则不能产生这种作用。2.1.2双链分子nfsiRNA(smallinterferingRNA)分子是3′端有突出的非配对碱基的双链分子,在细胞内可稳定存在3～4d,半衰期远长于反义寡聚核苷酸;RNAi还具有对靶mRNA的切割位点的准确性和高穿透性等特点。2.1.3缺失突变体表型的测定RNA干扰抑制基因表达具有很高的效率,对目的基因表达的抑制可以达到缺失突变体表型的程度;而且数量相对很少的dsRNA分子(数量远少于内源mRNA的数量)即能完全抑制相应基因的表达,许多生物学和遗传学证据表明,RNA干扰效应中存在信号分子的扩增机制。2.1.4rna的去除基因检测dsRNA分子能够通过细胞膜、细胞间隙和细胞屏障而被转运。如经线虫小肠微注射或浸润喂食线虫的方法进入其体内的dsRNA能被有效转运至全身各处,在各组织中对靶基因进行抑制,在体细胞和生殖细胞中都能检测到RNA的表达,并且其子代也产生了对靶基因强烈而特异的抑制效应。说明RNA干扰机制中可能存在维持mRNA降解序列特异性的信号分子。但这种遗传只限于子一代,子二代往往又回复到野生型。Palauqui等研究发现,转基因引起基因沉默的植株可以通过嫁接从沉默砧木传播到未沉默接穗上,通过将含有已沉默基因的植株嫁接到未沉默基因的寄主植株上,诱发寄主植株发生了RNA干扰。2.1.5rnai相关atp的形成过程去除内源性ATP后,dsRNA对目的基因的抑制作用明显降低或消失,而加入外源性ATP后,仍不能加强其抑制作用,显示RNAi是一个ATP依赖的过程。Zamore等认为,RNAi中至少有两个过程需要ATP供能:一是dsRNA被Dicer酶酶切产生siRNA;二是siRNA与RISC结合解链后形成有活性的RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。2.2相关分子的整合Dicer酶是一种ATP依赖性核酸内切酶,属于RNaseⅢ酶家族的成员之一。Dicer酶能产生RNA干扰所必需的siRNA和miRNA(microRNA),这些小的RNA的特性由Dicer酶蛋白的结构决定;Dicer酶蛋白包括RNAHELICs、PAZ、RNase和dsRNA结合域。不同生物体具有不同数量的Dicer酶,各Dicer酶既有功能上的各自独立,又有冗余和交叉。在进化过程中,Dicer酶的数量逐渐减少,却逐步整合从而表现出更多功能。siRNA是通过Dicer酶或类Dicer酶从长的双链RNA切割产生或通过化学途径合成的,大小为21～25个核苷酸(nt),siRNA可以与多细胞蛋白结合形成RISC。RISC是一种核酸和蛋白质的复合物(包括蛋白质和siRNA),可以将同源的mRNA分解成siRNA;RISC已经在果蝇和人类细胞中得到纯化,而且都含有Argonaute蛋白家族的成员,这种蛋白被认为是该复合物的核心成分。Tabara等的研究表明,Argonaute蛋白质RDE-1、QDE2和AGO1是RNAi过程中至关重要的成分,其作用与蠕虫、果蝇和植物中的干涉过程类似。Argonaute及其同源蛋白质的分子量大约100kD,称为PPD蛋白质,均含有PAZ和PiWi结构域;PAZ结构域有一个很稳定的褶层和一个桶状中心,侧旁的附属物能与长于5nt的单链RNA和双链RNA呈现很弱的结合。RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-directedRNApolymerase,RdRP)在转录后基因沉默中起着重要作用。现已从植物中分离纯化了RdRP,通过SDS及天然条件下蔗糖密度梯度离心测定其分子量分别为128和115kD,二者相差约10%,揭示RdRP可能是一种球状蛋白。实验显示,RdRP在无引物条件下也可以催化转录,其主要作用是放大RNA沉默信号,使双链RNA得到扩增。目前已发现多种RdRP蛋白,如:SGS2/SDE1、RDR2、EGO-1、QDE-1等。2.3双链犯罪分子roisc-pcr的分子毒性变化遗传学和生物学的研究表明,RNAi是一个非常复杂的过程,涉及许多未知功能的蛋白质。近年来的研究表明,长的双链RNA在类似于RNaseln的Dicer酶的作用下,通过核酸内切作用,以ATP依赖的方式在胞浆中断裂生成21～23nt的siRNA分子,而具有发夹环结构、长度为70～80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)则被切割为21～25nt的双链miRNA;siRNA和miRNA的作用机理相似,与核蛋白粒子(RNPs)结合,分别形成siRNA核蛋白复合物和miRNA核蛋白复合物,然后重排为RNA诱导沉默复合物。一般将含有siRNA的复合物称为RISC,而将含有miRNA的复合物称为miRNP。复合物中只含有小RNA的一条单链,由于反义链(与靶RNA互补)的5′端热力学稳定性较差,因此反义链形成复合物的机率较高,沉默效率也较高,该过程需消耗ATP。siRNA为RNAi的触发物(trigger),称为小干涉RNA,它是RNA干扰赖以发生的重要中间效应分子,siRNA的序列与所作用的目的RNA的序列具有同源性。长的双链RNA被切割成siRNA的过程中,Dicer酶起重要作用。PAZ结构域首先识别双链RNA分子3′端突出的2个单链碱基,起锚定作用,dsRBD结构域识别并结合双链RNA分子5′端,与PAZ结构域联合固定Dicer酶,最后在RNaseln活性域的作用下切割双链RNA分子成siRNA分子。siRNA是RNAi的效应物,两条单链末端具有5′磷酸基团和3′末端具有2nt突出的非配对的碱基。这种结构对于siRNA有效地引发RNAi反应是相当重要的。双链siRNA与一种蛋白复合物相结合,这种蛋白复合物含有一个siRNA和一个蛋白核酸酶分子,在siRNA的指导下,蛋白复合物形成了一种有活性的RNA诱导的基因沉默复合体RISC,然后RISC中的siRNA引导沉默复合物识别靶向同源mRNA,接着RNA解旋酶完成靶向mRNA与siRNA正义链换位,在少量ATP参与的情况下,RNase在距离siRNA3′端12nt处切割靶mRNA,并使其降解,从而达到转录后基因沉默(PTGS)的结果。哺乳动物中的RNAi主要以RISC为主,但植物中的RNAi还可以另外一种形式进行,即RNA依赖RNA聚合酶RdRP。在RdRp介导的沉默中:首先,被导入的dsRNA直接与目标mRNA形成双链,然后在Dicer酶的作用下形成siRNA,再进一步以siRNA的反义链为引物、目标mRNA为模板,在RdRP作用下发生类似PCR反应,形成新的dsRNA,新形成的dsRNA被Dicer再次切割形成siRNA,达到干扰目的基因表达的效果。Simmer等在裂殖酵母上的研究表明,RdRp(Rdp1)可以在体内从目标RNA模板合成RNA,产生的这些RNA不与发夹结构(hairpinstructure)同源。3双元回归系统的rnai表达植物中RNAi的诱导方法包括农杆菌(Agrobacterium)介导法、粒子轰击法、聚乙二醇(PEG)介导法、电击穿孔法、病毒介导法(virus-inducedgenesilencing,VIGS)等。农杆菌介导法快速、可靠、成本低,用于将dsRNA引入植物使基因沉默,也是常用的RNAi的诱导方法;粒子轰击法相对快速,但转化效率较低;PEG介导法及电击穿孔法等已在多种不同种属的植物中成功应用,但其周期过长不适于大规模鉴定基因功能。病毒介导的基因沉默是一种研究基因瞬时表达的新方法,它利用改造的病毒作为载体,这种改造的病毒无致病能力或只表现出很轻的病症,并且能复制,把这种载体通过体外转录直接侵染植物或通过农杆菌介导、基因枪的方法,就可把目的基因序列导入宿主内,病毒便在植物内复制和传播,从而诱导基因沉默。在植物RNA干扰的研究中,无论是验证未知基因功能还是改良作物品质,构建相应的RNA干扰表达载体都是最基本的试验步骤和必要方法,尤其是在应用RNA干扰技术进行作物品质改良时,要得到可稳定遗传的转基因植株,构建RNAi的表达载体必不可少:由于要诱发植物中的RNA干扰机制,必须要求导入的外源基因片段具有正反相连的RNAi结构。所以,构建高效的植物RNAi表达载体,对于RNAi技术在植物学领域的应用具有重要的推动作用。用能够表达产生dsRNA的质粒或病毒载体转化植物,或者通过转基因及病毒感染的方法在植物中过量表达单链RNA从而引起共抑制反应,都可以在植物中引发RNAi。其中利用T-DNA插入在植物中诱导产生RNAi的技术路线在拟南芥和水稻(Oryzasativa)等模式植物的功能基因组学研究中得到了较为广泛的应用。该路线的原理如下:PCR扩增目标基因的cDNA片段,分别以正向和反向插入双元植物表达载体,由强启动子驱动转录,正反片段之间由一段载体上的内含子序列隔开以维持载体的稳定性;该系统在植物细胞中转录产生带发夹结构的dsRNA,引发RNAi,从而抑制目的基因的表达。4内部干扰对植物的科学研究4.1rna干扰体测试在后基因组时代,人们迫切需要一种工具大规模地研究基因的功能。RNAi技术有逆基因分析的特点,通过特异地抑制靶基因的表达,获得功能丧失或降低的突变体,进而找出该基因对细胞发育、分化及功能的相应联系,同时对邻近基因的结构、功能及表达无影响。RNA干扰在植物中被发现作为干扰核酸的机制而存在,例如通过小的(20～26nt)RNA分子干扰病毒和转基因的表达,也是植物的一种防御方式。近来研究发现,RNA干扰通过多种途径发生,内源干扰途径在基因转录、RNA的稳定性及翻译水平上发挥了重要作用。2010年,Vaistij等证明,在拟南芥中可以通过RNA干扰来抑制miRNA的积累;通过运用设计的靶向初级miRNA转录和启动子的发夹RNAi结构,可以显著地降低miR163和miR171a的积累;靶向的启动子区域DNA的甲基化表明抑制miRNA初期的转录是可行的,可以实现miRNA表达的敲除,从而为打乱miRNA的目标配对和研究miRNA的功能提供了一个简单的方法。在棉花(Gossypiumspp.)纤维中基因编码的类成束蛋白-阿拉伯半乳聚糖蛋白质(fasciclin-likearabinoglactanproteins,FLAs)的作用通过构建RNA干扰体进行验证;根据GhAGP4的序列的RNA干扰使mRNA的水平显著下降,其他3个FALs蛋白则部分受到抑制;在转基因植株中,纤维的初始长度和伸长受到抑制,成熟的转基因棉花纤维的长度明显变短并且纤维质量变差。对GhAGP4的RNA干扰影响了纤维细胞中纤维素的沉积。在培养过程中,GA3可以上调FLAs基因的表达,特别是GhAGP2和GhAGP4,结果表明FLAs基因对纤维的初始长度和伸长起着十分重要的作用。康国章等采用RT-PCR方法从小麦(Triticumaestivum)品种的发育籽粒中克隆出SSIII基因部分cDNA片段,并以pWM101质粒为基础构建了由35S启动子调控的SSIII基因的反义表达载体,还以pF6C5941质粒为基础构建了SSIII基因的RNAi干扰载体,把这两种载体导入小麦中,可降低或抑制SSIII基因的表达,通过分析转基因小麦籽粒内支链淀粉组分的变化来研究SSIII基因在调控小麦支链淀粉合成中的作用。RNAi技术能快速、高效、特异地使靶基因失活,从而可以非常有效地鉴定特定基因的功能,为解析植物基因的功能开辟了一条捷径。研究鉴定植物中的优良基因或致病基因,可以给育种工作及减轻病害提供帮助,在农业生产上有指导意义。4.2抗wsmv基因的基因表达利用RNAi技术的原理,根据病毒的基因序列设计与之同源的dsRNA,导入到植物中,引发RNAi,可以对病毒进行特异性的切割,达到抑制病毒的作用。小麦条纹花叶病毒(wheatstreakmosaicvirus,WSMV)通过小麦卷叶缨螨(wheatcurlmite)传播,对美国和加拿大平原地区的经济有很大影响。2010年,Fahim等在澳大利亚发现了小麦条纹花叶病毒,该病毒在小麦种植区迅速传播。由于在小麦体内很难找到抵御这种病毒的抗体,促使其通过基于RNAi的方法构建转基因抗体。小麦可以和两种质粒稳定地共转化:表达包含WSMV序列的发夹RNA(hairpinRNA)的pStargate-NIa质粒和含有nptII选择性标记的pCMneoSTLS2质粒。Southern印迹杂交分析表明,hpRNA整合到了小麦基因组中,而且来自hpRNA转基因序列的小RNA的积累与免疫力呈正相关关系,证明通过这种技术产生非标记的WSMV免疫的转基因植株是可行的,这是第一次在小麦中报告运用捻接内含子hpRNA表达的策略来对WSMV产生免疫。马铃薯(Solanumtuberosum)是世界上广泛种植的粮、菜、饲兼用型作物,在我国干旱、半干旱地区种植面积较大,但对病害比较敏感。马铃薯中StRFP1基因抵抗晚疫病的功能已经通过表达和构建RNA干扰媒介进行了深入的研究,发现过表达StRFP1基因的植株致病比正常植株慢,用RNA干扰把StRFP1基因沉默掉则对病原体的感染敏感,证明StRFP1基因对抵抗马铃薯中的致病疫酶起着很重要的作用。棉花病虫害是制约其产量和品质的重要因素之一,每年可造成大量减产。棉花曲叶病毒在巴基斯坦、印度等热带地区经常肆虐,减产和经济损失严重,Asad等通过构建含棉花曲叶病毒DNA的载体转化烟草(Nicotianatabacum)表达病毒正义和反义的RNAs,结果25%的转基因烟草显示稳定的病毒抗性。姜洋等通过农杆菌LBA4404介导,转化携带pTiC58T-DNA的烟草叶片,获得携带正、反向吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)序列的转基因植株,ELISA分析生长素的结果表明,转基因植物叶片的内源生长素含量明显降低,仅为pTiC58T-DNA转化植株的56%,说明转基因烟草中发生iaaH基因转录后沉默,为利用该基因序列启动RNA干扰、抑制冠瘿瘤病发生提供了依据。对抗病毒转基因烟草进一步研究发现了dsRNA和siRNA,说明转录后基因沉默是最有可能引起抗病毒的机制;这些研究为以后在棉花上应用RNAi进行抗棉花曲叶病毒研究指明了方向,也为其他抗病毒研究工作提供了有益的参考。在植物的抗病性研究方面,通过RNAi技术,可以特异地抑制相应的致病基因,不仅保护了植物,在农业生产上也增加了收益。4.3采用rnai技术的基因表达随着生活水平的提高,人们对植物所提供产品的要求也越来越高,例如要求食物的主要营养成分含量更高且比例更平衡,抗营养成分更少。传统的育种方法显然不能完全满足人们的需求,而RNAi技术的出现使一切成为可能。利用RNAi技术可以改变花色。应用RNAi技术干涉与色素形成有关的基因,能诱导产生一些不同寻常颜色甚至花型的花,如日本和澳大利亚研究者利用RNAi沉默玫瑰(Rosarugosa)中二氢黄酮醇4-还原酶基因,培育出了蓝色玫瑰。Shoji等在郁金香(Tulipagesneriana)花色试验证明,TgVit1基因的表达和TgFER1基因的抑制对花被底部的蓝色是至关重要的。利用RNAi技术可以提高油酸含量。陈苇等利用已获得的甘蓝型油菜(Brassicanapus)种子贮存蛋白——十字花科蛋白(cruciferin)基因的启动子和终止子,构建了无选择标记基因且同时具有正义和反义结构的油酰去饱和酶基因(Fad2)种子特异表达RNAi载体,并通过农杆菌介导转化,获得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表达受抑制的转基因植株。RT-PCR分析结果表明,在油酸含量达83.9%的转基因植株中未检测到在非转基因植株中普遍存在的Fad2基因转录mRNA——一种典型的RNA干扰现象,通过对植株生长发育状态的观察比较,该高油酸含量转基因株系并未表现出双突变体中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、发育迟缓、花蕾死亡、结实率低等不利的农艺学性状。李兰玉等利用甘蓝型油菜种子特异性贮存蛋白基因cruciferin启动子及NOS终止子构建了无选择标记基因且含有反义结构的油酸脱饱和酶基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导法,获得了无选择标记转基因植株。再生植株的PCR检测表明,外源基因已高频率地整合到油菜基因组中,而且脂肪酸含量分析表明,获得的转基因种子油酸含量比对照有了很大的提高。钱春等指出,纤维素酶、果胶裂解酶和伸展蛋白是参与草莓(Fragariaananassa)果实成熟软化的关键因子,并提出了利用RNA干扰等生物技术对关键基因进行调控,降低相关酶的mRNA表达,提高草莓果实硬度从而延长保存时间的研究思路。利用RNAi可以改善植物中营养物质的含量。Ogita等利用RNAi技术抑制咖啡植物中编码可可碱合成酶(CaMXMT1)基因的表达,转基因植物中可可碱含量下降了30%～80%,咖啡因含量下降50%～70%。柴晓杰等克隆了玉米(Zeamays)淀粉分支酶(starchbranchingenzymes,SBE)基因,构建了高效的siRNA表达体系,通过花粉管通道法导入玉米自交系,Northern杂交分析