利用prim-er50技术优化球毛壳nd35菌株的rapd分析

利用prim-er50技术优化球毛壳nd35菌株的rapd分析

球毛壳nd35是一种具有优势的陆生真菌。它对番茄灰霉菌、番茄早病菌、黄瓜假病菌和其他致病性菌的生长有不同程度的抑制作用。人工接种也证明了对各种病原体的生防潜力，如杨树腐败、苹果腐败、番茄腐败和rizorculari。在温室和农村地区的生防试验中，对苹果树腐败和其他腐败病具有良好的抗性。这是一种潜力巨大的抗生菌。为了解球毛壳ND35在植物中的定殖情况,戴杨等利用SCAR标记建立了一套检测体系。本研究利用该体系,结合实时荧光定量PCR技术建立了更准确的球毛壳ND35菌株检测体系,为今后对内生真菌球毛壳ND35的定殖情况进行动态检测奠定了基础。1材料和方法1.1内生菌球毛壳供试植物:杨树为1年生107杨树扦插苗,黄瓜为津研4号4叶期黄瓜苗。内生菌球毛壳ND35菌株,由山东农业大学植物病理系资源微生物研究室提供,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上25℃培养,4℃冰箱中保存。供试杨树于扦插第一年根部接种球毛壳ND35菌株。1.2提取各组dna参照CTAB法提取接种植物基因组总DNA。1.3cr引物分析根据戴杨等的报道,利用Primer5.0软件设计一对荧光定量PCR引物,引物序列为ND35-1:5′-GCTCGCAGCTCTGGTGCGGTG-3′,ND35-2:5′-GCCGATTGCCCATGTCCACCTC-3′,引物预计扩增片段为156bp。1.4nd33-2的制备25μl反应体系为:ddH2O9.5μl,2×SYBRGreenMix12.5μl,引物ND35-1和ND35-2各0.5μl,模板DNA2.0μl。反应条件为:94℃预变性2min;94℃变性20s,58℃退火20s,68℃延伸20s,共45个循环;最后68℃延伸3min。每个循环延伸结束采集荧光信号,反应结束后先加热到95℃,然后降至55℃,再缓慢升温(0.5℃/s)至95℃,记录荧光信号的变化,得出扩增产物的熔解曲线。1.5nd35柳树和黄瓜的生殖器测试1.5.1实时荧光定量pcr特性采集不同生长季节的杨树组织,提取基因组DNA,利用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因设计内参引物对GAPDH-1、GAPDH-2及特异引物对ND35-1、ND35-2进行实时荧光定量PCR实验,分析不同生长季节间球毛壳ND35菌株的定殖情况。1.5.2实时荧光定量pcr检测黄瓜生长部位的优化在黄瓜根部接种球毛壳ND35,3周后分别采集根、茎、叶部的组织,提取基因组DNA,利用内参引物对GAPDH-1、GAPDH-2及特异引物对ND35-1、ND35-2进行实时荧光定量PCR实验,分析同一时间黄瓜不同生长部位球毛壳ND35的定殖情况。2结果与分析2.1实时荧光定量pcr反应体系的探索及检测利用SCAR标记获得的球毛壳ND35特异片段设计的一对用于实时荧光定量PCR试验的引物,以球毛壳ND35基因组DNA为模板,对实时荧光定量PCR反应的最佳体系、反应程序等进行了初步探索,得到了理想的结果。一般认为当进入对数期的循环数大于35时,实时荧光定量PCR检测无效,扩增曲线显示扩增Ct值在25～30之间,结果可信(图1);熔解曲线显示扩增有单一特异的峰,经过凝胶电泳显示此峰对应的片段即为目的片段(图2)。2.2球毛壳nd33的定殖量利用实时荧光定量PCR检测不同生长季节杨树根、茎、叶中球毛壳ND35菌株的定殖情况,结果显示,六、七、八、九月份杨树组织中球毛壳ND35的定殖量比较多,其中根部在七月份定殖量最大;茎中球毛壳ND35定殖量在六月份开始增多,七月份达到高峰,九月份以后逐渐减少;叶中球毛壳ND35定殖量在九月份显著增多,其它月份基本持平(图3)。2.3不同组织中球毛壳nd33菌株的分离培养利用实时荧光定量PCR对温室中黄瓜苗不同组织中球毛壳ND35菌株进行检测,结果表明黄瓜苗叶中球毛壳的定殖量最多,根部与茎中定殖量相对较少(图4)。3生防菌球毛壳的荧光定量pcr检测实时荧光定量PCR技术是近年发展起来的一种新的检测方法,与常规RT-PCR相比具有明显优越的灵敏度、特异性、稳定性和操作简便的特点。近些年来,实时荧光定量PCR技术还广泛应用于植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测、信号转导、环境对植物基因表达的影响等方面。在植物病虫害研究的许多领域显现出它的优越性,并开始被广泛应用。目前,活体生防木霉的分子检测技术已经建立,但尚未见国内外有应用实时荧光定量PCR技术对生防菌球毛壳进行分子检测的报道,本文首次报道了生防菌球毛壳的荧光定量分子检测技术。本研究建立并优化了利用SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测球毛壳ND35菌株定殖情况的体系,可以快速、准确地检测ND35菌株的定殖情况,为监测生防因子球毛壳ND35在田间的定殖打下了基础。研究球毛壳ND35菌株的分子标记以及在土壤或植物中随季