hplc法测定山核桃外蒲壳中球松素和大黄酚的含量

hplc法测定山核桃外蒲壳中球松素和大黄酚的含量

山核桃是核桃科的一种优良菌株。它是中国特有的优质干果和油树种。主要分布在浙江和安徽的交汇处山区。山核桃未成熟时核外部有一层厚厚的绿色外果皮,又叫外蒲壳,随着山核桃逐渐成熟并被采摘剥离后,该外果皮颜色会渐渐变为棕红色直至黑色。山核桃果实的集约化生产、加工,给农民带来巨大经济效益的同时,弃置野外的山核桃外蒲壳经雨水浸泡后,浸出液流入江、河、湖泊中,污染当地生态环境,危及动植物的生存。本实验在前期对山核桃外蒲壳活性成分研究的基础上,分离得到大黄酚、球松素等活性成分。球松素又名乔松酮,在生理学、医学和营养学上都有较高的应用价值,其具有广泛的生理和药理活性,包括抗病毒、抗癌、抗氧化、抗炎、延缓衰老等;大黄酚具有止血和抗衰老等药理活性。有文献报道东乐膏、六味安消胶囊中大黄酚含量测定方法和山核桃树叶中球松素含量测定方法,但目前尚未见用HPLC法测定山核桃外蒲壳中球松素和大黄酚含量的报道。国内外对胡桃科很多植物的化学成分及生物活性有比较全面和深入的研究,但对山核桃外蒲壳化学成分、生物活性的研究文献报道很少,尤其是质量控制方法方面。本论文从植物化学、药理学及质量控制的角度初步研究了山核桃外蒲壳的质量控制方法,为给综合开发利用山核桃外蒲壳资源提供科学依据,本实验建立了HPLC测定山核桃外蒲壳中球松素和大黄酚含量的方法。1仪器、试剂和仪器LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津,SPD-20A紫外检测器,N2010色谱工作站);BP211D型十万分之一电子天平(Sartorius);SK3200H型超声处理器(上海科导超声仪器公司)等。甲醇(色谱纯,MERCK,批号61860725001730);磷酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批号T20080108);水为娃哈哈纯净水。球松素、大黄酚均为实验室自制(TLC薄层鉴别,核磁C谱、H谱,质谱,红外光谱进行结构鉴定,HPLC面积归一化法测得含量为99.61%);山核桃外蒲壳于2008年采自安徽宁国,经安徽中医学院药学院中药学教研室刘守金教授鉴定为胡桃科山核桃属植物山核桃(CaryacathayensisSarg.)的外蒲壳。2方法和结果2.1流动相、柱温度和检测波长色谱柱:Shim-packC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液水(79∶21);流速:0.8mL·min-1;柱温:25℃;检测波长:286nm;进样量:20μL。2.2溶液制备2.2.1制备续滤液取山核桃外蒲壳粗粉约1.0g,精密称定,置于100mL烧瓶中,精密加入甲醇50mL,浸泡1h后,回流提取2h,冷却至室温,用甲醇补足减失质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.2.2对照品储备液的制备精密称取球松素、大黄酚的对照品适量,分别用甲醇溶解并稀释成含有20.6μg·mL-1球松素、67.0μg·mL-1大黄酚的单一成分对照品储备液。分别精密吸取对照品储备液适量,用甲醇稀释成含8.24μg·mL-1球松素、4.02μg·mL-1大黄酚的混合溶液,即得。2.3保留时间的确定在上述色谱条件下,分别取对照品溶液、供试品溶液各20μL进样。结果从色谱图中可以发现色谱峰峰形良好,保留时间适中,分离度大于1.5,理论塔板数为10000,球松素、大黄酚保留时间分别为14.5min、32.5min左右,色谱图见图1。2.4黄酚对混合对照品溶液的稳定性精密吸取“2.2.2”项下的球松素、大黄酚的对照品储备液适量,用甲醇配制成球松素浓度分别为4.12,8.24,16.48,20.60,25.75μg·mL-1,大黄酚浓度分别为1.005,2.010,4.020,8.375,13.40μg·mL-1的混合对照品溶液,分别进样20μL,记录色谱图。以对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,得到球松素、大黄酚回归方程分别为:Y=9.76×104X+1.05×103r=0.9999Y=4.75×104X+1.78×104r=0.9998结果表明:球松素、大黄酚浓度分别在4.12～25.7μg·mL-1、1.01～13.4μg·mL-1范围内与峰面积值均呈良好线性关系。2.5仪器精密度试验精密吸取上述“2.2.2”项下的对照品溶液20μL,分别连续进样6次,测定球松素、大黄酚峰面积,其RSD分别为0.36%和0.37%,表明仪器精密度良好。2.6供试品溶液稳定性取供试品溶液,分别于0,4,8,12,24h进样20μL,测定球松素、大黄酚峰面积,其RSD分别为1.5%和0.77%,表明供试品溶液在24h内稳定。2.7样品含量测定取山核桃外蒲壳粗粉,按“2.2.1”项下方法制备6份供试品溶液,进样20μL,测定样品含量。结果样品中球松素、大黄酚平均含量分别为0.0853%和0.0178%,RSD分别为1.3%和0.83%,表明本测定方法重复性良好。2.8加样回收率试验精密称取已知含量的山核桃外蒲壳粗粉约0.5g,共6份,分别精密加入“2.2.2”项下的对照品储备液各1mL,按“2.2.1”项下方法制备供试溶液,进样20μL,计算加样回收率平均值(n=6)分别为97.8%和98.0%,RSD分别为1.1%和1.7%。2.9样品含量的测量取3批样品,按“2.2.1”项下方法制得供试品溶液,进样测定,用外标两点法计算得球松素、大黄酚平均含量,结果见表1。3流动相的选择本研究过程中对提取方法、提取溶剂及用量和提取时间等实验条件进行了考察。结果表明,以甲醇回流提取最佳,用50mL甲醇回流提取2h已能将有效成分基本提取完全。分别对球松素和大黄酚对照品溶液进行了紫外扫描,结果发现它们有共同的最大吸收峰286nm,故选择286nm为检测波长。对流动相甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)、甲醇-0.1%磷酸溶液(79∶21)、甲醇-0.1%磷酸溶液(74∶26)进行考察。