以糖蜜废液为料源进行400L模场规模之酦酵产氢课件

以糖蜜廢液為料源進行400L模場規模之醱酵產氫

以糖蜜廢液為料源進行400L模場規模之醱酵產氫1

摘要本研究以產製麩胺酸的副產物－濃縮糖蜜醱酵廢液(condensedmolassesfermentationsoluble)為料源進行400L模場的產氫試驗，分別探討基質濃度(substrateconcentration,Cs)及水力停留時間(hydraulicretentiontime,HRT)對系統產氫之影響，並藉分子生物技術分析反應器菌群結構。結果顯示，系統可於HRT6h(Cs=40gCOD/L)成功啟動，產氫速率、氫氣產率分別可達5.01L/L/d及1.19molH2/molhexose，但隨操作的持續進行，系統之產氫效能發生週期性升降的現象，致使系統呈現不穩定操作的現象；即使將HRT降為4h及基質濃度增為70gCOD/L亦無法有效改善此問題，然而透過基質預熱策略(60oC,1h)則可明顯改善此問題，於HRT4h及基質濃度70gCOD/L(總糖濃度17.7g/L)之條件，產氫速率及氫氣產率分別可達17.8Nm3/m3/d及1.64molH2/molhexose。菌群結構分析顯示，基質預熱可使原存於系統中之Corynebacteriumglutamicum(生產麩胺酸之工業用菌株)逐漸消失並優勢化Clostridiumsp.，因而提升系統之產氫效能，使系統由不利於產氫之乳酸醱酵轉變成有利於產氫之丁酸醱酵。另外，基質預熱操作後約10天，發現系統中存在可分解醣類及乳酸而產生氫氣之Megasphaerasp.，由液相代謝物組成之乳酸含量降低推測其對於產氫具有相當程度的貢獻。

摘要2

一、前言

氫氣燃燒使用後只產生水，並無污染之虞，應用於燃料電池(fuelcell)發電具有高能源轉換效率，因此被期許為未來的能源主流之一(Levinetal.,2004)，而如何以高經濟效益的方法獲取氫氣實為當今重要的課題。相對於高溫高壓之熱化學法(thermochemicalmethod)產氫，生物產氫可於常溫常壓下轉換有機物獲取氫氣，不僅具低耗能的特點，應用於有機廢棄物處理則兼具能源再生及生態循環之功能(李等，2007)。生物產氫可分為光合作用(photosynthesis)與醱酵作用(fermentation)兩大類。光合作用是以藻類(algae)或藍綠細菌(cyanobacteria)等在光照下進行水的分解(biophotolysis)而產生氫氣(Asada&Miyake,1999)。醱酵作用則利用光合菌或厭氧菌進行有機物的醱酵轉換而產生氫氣，其中光合菌醱酵產氫因需藉光能而稱為光醱酵作用(photofermentation)(Asada&Miyake,1999)，相對的厭氧菌醱酵產氫因不需光能而稱為暗醱酵作用(darkfermentation)(Lin&Chang,1999)。相對於光醱酵作用，暗醱酵因具有較高的產氫速率及不受日光限制等優點，近年來逐漸受到世界各國的重視與期待(Levinetal.,2004)，其產氫菌包括Enterobacter、Bacillus及Clostridium等菌屬(李等，2007)。

一、前言

3二、材料與方法2.1產氫菌的來源及篩選本研究使用之污泥取自雲林縣台西鄉海岸潮間帶之污泥。取回之污泥先以95-100ºC熱處理(Linetal.,2000)維持1小時，以去除甲烷菌等耗氫菌。並於實驗室以糖蜜醱酵廢液進行產氫菌之馴養，以獲得具優勢產氫菌之植種菌液。二、材料與方法42.2產氫料源產氫料源取自味丹企業股份有限公司的濃縮糖蜜醱酵廢液，糖蜜廢液為該公司生產味精時所產生的副產物，溶解性COD約為400gCOD/L，總糖含量約為100g/L，由於糖蜜廢液含有豐富的營養鹽供給微生物生長，因此未額外添加其他營養鹽及微量金屬，進料時僅依設計濃度將糖蜜廢液稀釋至所需濃度，並添加適量Na2CO3作為緩衝劑。以糖蜜废液为料源进行400L模场规模之酦酵产氢课件5

實驗方法

本研究以有效體積400L的CSTR反應器進行產氫操作，系統啟動時先於反應器內植入60L經糖蜜廢液馴養的產氫菌液及340L培養基(40gCOD/L)，充分混合後曝以氬氣使系統呈現厭氧狀態並於37℃進行批次培養，待菌體活化後即以水力停留時間(hydraulicretentiontime,HRT)6h進行系統之啟動，隨後並於進行各種不同基質濃度(40-70gCOD/L)與HRT(6-4h)之產氫試驗，其培養溫度及pH分別控制於為37℃及5.5，並於實驗過程中監測pH、ORP值變化，操作過程所產生之氣體則經GasMeter計算其產氣量。

實驗方法

本研究以有效體積400L的CSTR反應器進行6

氣體組成分析

以氣相層析儀(CHINAChromatograph8700T)進行氣體組成分析，使用之偵測器為熱傳導偵測器(thermalconductivitydetector,TCD)，載體(carriergas)為氬氣，管柱為1/8mmID*4m不鏽鋼管，注射口溫度175ºC，偵測器溫度100ºC，管柱溫度55ºC。

氣體組成分析

以氣相層析儀(CHINAChromato72.4.2液相組成分析以液相層析儀(SHIMADZULC-10ATLiquidChromatograph)進行溶解性代謝物(solublemicrobialproduct,SMP)組成分析，使用之偵測器為折射率偵測器(refractiveindexdetector,RID)，使用的管柱(column)為COREGEL87H3，其移動項(mobilephase)為0.005NH2SO4，溫度為35℃，流速為0.6mL/min。2.4.3水質分析化學需氧量(chemicaloxygendemand,COD)以及揮發性懸浮固體物(volatilesuspendedsolid,VSS)皆依據水質分析標準方法(APHA,1997)檢測之。總糖濃度以酚-硫酸法(phenol-sulfuricacidmethod)測定(Duboisetal.,1956)。2.4.4掃描式電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope,SEM)觀察樣本之製備取自反應器內之菌液先以玻璃纖維濾紙過濾，而後將含菌體的濾紙置於2.5%的戊二醛溶液中浸泡3小時以上以進行菌體之固定，隨後再依序浸於濃度為50%、70%、80%、90%、95%的乙醇(ethanol)溶液中各30分鐘，再將樣本置換到100%乙醇溶液中保持脫水狀態，後續乾燥、上檯、鍍膜以及觀察技術則委託相關專業技術單位，該單位使用機型為HITACHIS-3000NSEM。以糖蜜废液为料源进行400L模场规模之酦酵产氢课件82.4.5聚合酶鏈鎖反應將污泥樣品中所萃取出的微生物DNA進行聚合酶連鎖反應，依據不同的分析目標設計各自專一性的引子(primer)，此引子為一段與DNA片段互補的序列，經反應後可放大特定目標之DNA片段，則所合成的DNA片段便可用以作為後續鑑定菌群之依據。PCR反應所需的混合試劑PCRmastermix2X(Promega,USA)，成分包含：25units/mlTaqDNAPolymerase、200μMdNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)和1.5mMMgCl2，以及引子各0.2μM與適量templateDNA，利用聚合酶連鎖反應器iCycleTMThermalCycler(Bio-Rad,USA)操作在三種溫度下循環以利用酵素進行DNA合成。本研究所使用的引子及接合溫度(Ta)如表1所示。PCR反應結束後，利用瓊脂膠糖明膠電泳(Agarosegel)確定其產物長度以判斷產物是否正確。依據不同長度之產物配置適當濃度的膠體(表2)，將PCR產物與loadingdye依比例混合後，以100伏特電壓進行電泳，待loadingdye移動至膠體底部的三分之一時停止電泳。最後將膠體浸入含0.5μg/mL之EthidiumBromide染色10分鐘後，以紫外光顯像並拍照。以糖蜜废液为料源进行400L模场规模之酦酵产氢课件92.4.6變性梯度明膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)主要針對的目標在於序列長度相同而鹼基組成不同的PCR產物進行分析，其靈敏度最高可區分出一個鹼基差別的DNA片段，藉此可判別出屬於不同specie甚至不同strain的菌株。配製具有變性劑濃度梯度的膠體，藉由不同濃度變性劑所提供之能量強弱不同，打斷構成雙股DNA結構能力的氫鍵，使DNA變性；樣本經由DGGE分析後，在電泳膠片上所呈現多個不同位置之亮帶即代表不同DNA序列，藉由分析電泳膠片上之亮帶多寡與位置的差異，來瞭解系統中微生物族群的多樣性程度。配製變性梯度膠時，首先準備變性梯度之最高及最低變性劑濃度(high/lowdenaturedensitysolution)，以gradientformer(BioRad)進行變性梯度膠體之配製，並使用變性梯度凝膠電泳槽(DcodegeneSystem,Bio-Rad)，以80伏特電壓及60ºC條件下進行電泳12h，最後利用Ethidium以糖蜜废液为料源进行400L模场规模之酦酵产氢课件10Acrylamide/Bis膠體之DNA純化以引子968f-gc/1392r進行16SrDNA放大之PCR產物，經由DGGE分析後，再將DGGE膠體上相異的band分別切下後置於無菌水中，以凍融法獲取目標DNA片段；為檢視切下的band，必須重複進行PCR-DGGE與切膠純化的分析直至確定為單一亮帶為止。純化的DNA再利用無GCclamp的引子組(例968f&1392r)將DNA放大後，即可將DNA做其後續研究或送交生技公司進行定序，再將其定序結果經由NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)網站所提供NucleotideBlast服務進行菌種DNA序列比對。以糖蜜废液为料源进行400L模场规模之酦酵产氢课件11三、結果與討論系統啟動為了縮短系統啟動時程，本研究以HRT6h來啟動系統。反應器首先植種約60L之產氫污泥，並置入約340L糖蜜廢液作為培養基(40gCOD/L)，充分混合後充以氬氣使系統呈厭氧狀態，並於37℃及pH5.5之條件下進行批次培養。待氫氣生成即以基質濃度40gCOD/L及HRT6h之條件進行系統之啟動，啟動後氫氣濃度快速攀升至約40%，但僅維持約半日即下降至34%，其產氫速率(H2productionrate,HPR)可達3.3Nm3/m3/d，約1.5日後，氫氣濃度再度下滑至30%左右，並伴隨產氣量的下降，導致HPR顯著下降至2.3Nm3/m3/d。而後氫氣濃度略下降至27%，致HPR再略下降至約2.0Nm3/m3/d(如圖1)。直至第5日，雖然氫氣濃度仍維持於27%，但由於產氣量的增加導致HPR攀升至3.3Nm3/m3/d。第8日後，氫氣濃度及HPR分別可穩定維持於31%及5.0L/L/h，顯示糖蜜廢液醱酵產氫可採用較低的HRT(6h)來啟動，並於啟動後約一週逐漸趨於穩態操作。當系統操作至第11日時，由於進料幫浦發生故障，系統被迫停止進料，於三、結果與討論1212小時內修復後重新啟動進料，啟動後產氫狀態迅速恢復，顯示該系統對進流基質的擾動具有高度的緩衝能力。本啟動操作初期，氧化還原電位(oxidationreductionpotential,ORP)約為450~500mV之間，後期產氫較佳狀態之ORP約為500~580mV，推測與絕對厭氧菌Clostridiumsp.逐漸形成優勢產氫菌有關。本試程穩態操作之生物質量濃度為9.1gVSS/L(如表4)，推測其中部分為糖蜜廢液中原本即含有之生物量所致。此外，穩態操作之基質利用率約為72%(如表4)，顯然低於蔗糖產氫之利用率，其原因尚不明，有待進一步探討。整體產氫表現而言，產氫速率(HPR)及氫氣產率(H2yield,HY)分別為5.01Nm3/m3/d及1.19molH2/molhexose，其HY約為理論值4.0molH2/molhexose的30%。12小時內修復後重新啟動進料，啟動後產氫狀態迅速恢復，顯示該13四、結論歸納本研究，模場系統進行糖蜜廢液醱酵產氫可於HRT6h(Cs=40gCOD/L)成功啟動，產氫速率、氫氣產率分別可達5.01L/L/d及1.19molH2/molhexose。但長期操作，系統因原存於料源中的Corynebacteriumglutamicum滋生並競爭基質，迫使Clostridiumsp.失去優勢，而使系統產氫效能下降。透過基質預熱策略可明顯抑制Co.glutamicum的生長，並優勢化Clostridiumsp.，因而改善此不穩定操作的問題，於HRT4h及基質濃度70gCOD/L(總糖濃度17.7g/L)之條件，產氫速率及氫氣產率分別可達17.8Nm3/m3/d及1.64molH2/molhexose。另外，基質預熱之操作，系統中亦發現存有可分解醣類及乳酸而產生氫氣之厭氧球狀菌Megasphaerasp.，推測其對於系統由不利於產氫之乳酸醱酵轉變成有利於產氫之丁酸醱酵具有相當程度的貢獻。四、結論歸納本研究，模場系統進行糖蜜廢液醱酵產氫可於HRT14

五、參考文獻

1.APHA.“StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater,19thedition,”AmericanPublicHealthAssociation,NewYork,USA.(1997)2.AsadaY,MiyakeJ.Photobiologicalhydrogenproduction.JBiosciBioeng1999;88(1):1-6.3.Auli,H.1991.TheGeneraPectinatusandMegasphaera.InAlbert,B.,G.T.Hans,D.Martin,H.Wim,andK.Karl-Heinz(ed.),TheProkaryotes.VolII.Springer-Verlag,NewYork,pp:1993-2004.4.Das,D.,andT.N.Veziroglu.2001.Hydrogenproductionbybiologyprocesses:asurveyofliterature.InternationalJournalofHydrogenEnergy26:13-28.5.FranksAH,HarmsenHJ,RaangsGC,JansenGJ,SchutF,WellingGW.“Variationsofbacterialpopulationsinhumanfecesmeasuredbyfluorescentinsituhybridizationwithgroup-specific16srRNA-targetedoligonucleotideprobes,”ApplEnvironMicrobiolVol.64,pp.3336-3345(1998).6.Lee,K.S.,Lin,P.J.,Fangchiang,K.,Chang,J.S.,(2007),“Continuoushydrogenproductionbyanaerobicmixedmicroflorausingahollow-fibermicrofiltrationmembranebioreactor”,Int.J.HydrogenEnergy,32,pp950-957.7.LevinDB,