参元丹胶囊对动脉内皮损伤大鼠血浆e、angii、nos的影响

参元丹胶囊对动脉内皮损伤大鼠血浆e、angii、nos的影响

参元丹（syd）是根据不稳定型心绞痛（unstab.a）缺血性抑郁综合征患者的临床特征设计的处方。根据以往的研究，气虚血虚的临床治疗具有良好的临床疗效。疗效机制可能与其调整UA患者血管内皮功能,促进纤溶功能有关。本研究观察参元丹对动脉内皮损伤大鼠血浆内皮素(ET)、血管紧张素Ⅱ(AngII)及血清一氧化氮合酶(NOS)的影响,以进一步阐明其作用机制,为临床用药提供实验依据。仪器与检测方法1.实验动物健康成年Wistar大鼠80只,雌雄各半,体质量(396±29)g,鼠龄4月左右,清洁级。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物合格证号:SCXK(京)2002-0014。大鼠饲养和实验均在北京市中医研究所清洁级实验动物室内进行。2.药物参元丹,药物组成:黄芪、党参、土元、水蛭、玄参、丹参、延胡索、地龙等。将组成药物以10倍量常水煮提3次,每次30min,合并煮提液,浓缩至每毫升内含生药1g的清膏供用。由北京中医医院制剂室提供,为北京市药监局备案制剂,批准文号为(99)京卫药制字第F-2037号。通心络胶囊主要组成:人参、水蛭、全蝎、虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍药、冰片等。生产厂家:石家庄以岭药业有限公司生产,每粒0.38g,生产批号9906115。合心爽30mg/片,天津田边制药有限公司生产,批号津卫药准字(1993)第002430号。3.药品、试剂与仪器、材料3.1药品戊巴比妥钠,BDH,AR级,使用前用灭菌注射用水配制成3%的浓度。高渗液制备:将Krebs溶液(1)中各成分增加20%以配成高渗液。成分如下(mmol/L):NaCl113.75(94.79)、KCl5.63(4.69)、CaCl26.07(5.06)、KH2PO41.42(1.18)、MgSO4·7H2O1.28(1.07)、NaHCO329.99(24.99)、glucose13.32(11.10)【注:()内为等渗Krebs溶液】。碘酒、10%中性甲醛,无水乙醇,95%乙醇,75%乙醇,苏木素染色剂,伊红染色剂,石蜡。3.2试剂与仪器ET测定按ET放免药盒(由北京北方生物技术研究所提供)操作程序进行。可测范围为20-1620pg/ml,灵敏度为10pg/ml,批内和批间变异系数分别为<5%,<10%。NOS采用比色法,药盒由北京北方生物技术研究所提供,测定按说明书操作程序进行。AngII测定按AngII放免药盒(由北京北方生物技术研究所提供)操作程序进行。可测范围为25-800pg/ml,灵敏度为10pg/ml,批内和批间变异系数分别为<10%,<15%。所用仪器:721型光栅分光光度计、DKZ-2型电热恒温振荡水槽,上海医用电子仪器厂生产;FT-646A型微机放免仪,北京核仪器厂生产;低速离心机,上海安亭科学仪器厂生产;德国来卡脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机;光学显微镜;北航三高CMIAS99C型彩色病理图像分析仪。3.3材料改良F2硬脊膜外麻醉导管:将F2硬脊膜外麻醉导管[武进市政平乳胶制品厂生产,批号:国药管械(准)字2002第3660060号,苏药管械生产许20010178号,Q/320483ZR2001-2001,苏卫消字(2000)第3073号]前端1cm处的两端用4号半针头刺穿4-6个小孔,导管后连接1ml注射器。医用手术器械:剪刀、眼科剪刀、镊子、止血钳、医用缝合线、酒精、碘酒等。4.实验动物模型制备在参照唐朝枢及其他文献报告方法的基础上结合本院具体条件,改良并初步建立动脉内皮损伤大鼠模型。用3%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉大鼠后,将动物背位固定在鼠台上,除去颈部局部鼠毛,皮肤用碘酒和酒精常规消毒后,剪开皮肤约2-3cm长,依次分离皮下组织、肌肉并暴露气管,在气管左侧游离左颈总动脉1-1.5cm,将远心端结扎,近心端用动脉钳闭夹,于颈动脉远端用动脉剪剪一斜口,将导管插入胸主动脉约4-5cm长,反复牵拉5次,第6次插入胸主动脉后注入高渗液0.1ml保留90s,最后拔出导管,结扎左侧颈总动脉,逐层缝合皮下脂肪、肌肉及皮肤切口,碘酒涂擦切口。5.分组及给药、处理方法适应性饲养2周后,先取10只大鼠进行病理模型造模预实验,经病理证实造模成功后,将大鼠随机分为7组,假手术组、参元丹高剂量组、参元丹低剂量组、通心络组、合心爽组、正常对照组,病理模型组,每组10只。造模后常规饲养同时,参元丹低剂量组,给予参元丹清膏3.8g/(kg·d);参元丹高剂量组,给予参元丹清膏5.8g/(kg·d);通心络组0.2g/(kg·d);合心爽组2.5mg/(kg·d);连续给药14天。假手术组、正常对照组、病理模型组用饮用水灌胃14天。标本留取方法:各组于造模后第14天处死动物,取实验大鼠静脉血,分离血清和血浆,分别检测NOS、ET、AngII。动脉留取时剖开颈部,游离颈总动脉,向心端依次留取胸主动脉损伤血管病理标本1-2cm长,分别放入10%中性甲醛固定备用。病理检查:将病理标本在10%中性甲醛液中固定24h后,逐级乙醇脱水,石蜡包埋,间断均匀切片(每片厚5μm),制成组织切片备检。对病理切片进行常规HE染色,光学显微镜观察受损血管病理组织形态学改变,同时病理科协同采用彩色病理图像分析系统进行图像分析,测定血管内膜厚度。6.统计分析方法数据以x¯±sx¯±s表示,利用SPSS10.0统计软件进行统计学处理,组间比较用t检验,多组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有显著性的统计学意义。各组血浆et、nos、angii水平各组药物对动脉内皮损伤大鼠血清NOS,血浆ET、AngII的影响,见表1。ET:与正常对照组相比较,病理模型组明显升高,两者之间有统计学差异。与病理模型组比较,SYD高低剂量组、合心爽及通心络组均能够抑制ET水平的升高,与病理模型组之间均有显著性差异。与通心络组比较,参元丹高、低剂量组抑制ET水平作用更加明显,具有统计学差异。NOS:与正常对照组相比较,各组的NOS均有升高,具有统计学差异。与病理模型组相比,各治疗组均未见统计学差异。ET/NOS:与正常对照组相比较,病理模型组呈明显升高,两者之间有统计学差异。与病理模型组比较,SYD高、低剂量组、合心爽及通心络组均可抑制ET/NOS比值的升高,差异具有显著性意义。SYD低剂量组与合心爽组ET/NOS比值低于正常对照组,差异有显著性意义。与通心络组比较,参元丹低剂量组降低ET/NOS比值作用更加明显,具有统计学差异。AngII:与正常对照组相比较,病理模型组的AngII有升高趋势,但两组之间无统计学差异。与病理模型组比较,SYD高、低剂量组及通心络、合心爽对照组均可降低AngII水平,差异具有显著性意义。结果亦显示:与正常对照组相比,合心爽组,SYD高、低剂量组对血浆ET水平影响有显著性意义;通心络组、SYD低剂量组对血浆AngⅡ水平影响有显著性意义,但是具体影响因素有待于进一步分析研究。对血管内皮功能的调节在心血管疾病动物模型的研究中,大鼠主动脉机械损伤模型广泛应用于动脉内皮损伤后内膜增生的研究。有文献报告说剥脱内皮细胞可用高浓度KCL,但其机制不明,且这种方法只有在剥脱冠状血管内皮细胞时使用。在查阅相关文献并结合已有实验条件的基础上,笔者建立大鼠主动脉内皮损伤模型,研究中药参元丹对大鼠动脉内皮损伤后血清NOS、血浆ET、AngII水平的影响及动脉内皮损伤后内膜的增生情况。血管内皮细胞(vascularendothelialcells,VECs)既是血管壁的重要组成部分,又作为庞大的内分泌系统参与许多生理活动,它可以产生和分泌包括ET、NO、血管紧张素转换酶(ACE)在内的几十种生物活性物质,调节血管的舒缩状态,防止血小板黏附和血栓形成,调节血管平滑肌细胞生长和增殖,防止炎细胞浸润和有害物质渗入。研究表明内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的始动因素,内皮细胞功能障碍在冠心病发病过程中起着重要作用。内皮分泌的心血管活性物质,如NO、ET、AngⅡ等对心血管系统功能具有重要调节作用,并参与多种心血管疾病的病理生理过程。生理情况下,内皮分泌的ET具有缩血管效应,在ET产生的同时血管内皮细胞产生血管内皮舒张因子(EDRF),使血管平滑肌舒张,制约其效应。但是在病理状态下,如动脉内皮损伤后,血管内皮细胞受损,血管内皮收缩因子(EDCF)/EDRF之间的平衡被打破,缩血管物质ET释放比例增加,出现强烈的缩血管反应。AngⅡ经内皮释放,可直接作用于血管平滑肌细胞,引起血管收缩。NO是内皮细胞分泌的扩血管因子,是NOS将L-精氨酸转变为L-胍氨酸过程中的氧化产物,NO在体内代谢速度快,半衰期很短,难以直接测量,测定NO代谢产物及NO合成酶的浓度可反映内生性NO的变化。NO/ET两者共同维持血管张力,调节血管内皮功能。内膜过度增生增厚是造成血管狭窄和导致管腔面积缩小的重要病理机制。主动脉内皮损伤后关于内膜增殖的确切机制至今尚未完全阐明。近年来的研究发现,AngII能通过其I型受体激活黏着斑激酶(focaladhesioninase,FAK),促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移;同时ET-1尚可促进有丝分裂作用,使血管平滑肌增生。参元丹在益气扶正基础上,选用破血逐瘀之品,力求破血而不伤正。方中黄芪益气扶正,水蛭破血逐瘀,共为主药;党参补中益气,土鳖虫攻血破坚,共为辅药;地龙行经通络,玄参育阴软坚,丹参养血活血,延胡索行气活血止痛,共为佐使。合方共奏益气破血、滋阴养血、行气通络之效。笔者既往的临床研究提示,参元丹及合心爽对UA血瘀证患者均有较好的临床效果,但参元丹在改善患者全身症状方面较合心爽更具优势。动物实验显示,参元丹对内皮完整及去内皮家兔主动脉环盐酸去氧肾上腺素(phenylephrinehydrochloride,PHE)引起的收缩均有拮抗作用,对内皮完整动脉环作用明显强于去内皮动脉环,提示参元丹对血管环的收缩拮抗作用可能部分需要内皮功能的参与。笔者另外的实验结果显示SYD在明显降低大鼠急性心肌缺血时血浆ET水平的同时,能提高其NOS的水平,调节血管收缩/舒张的平衡,这也与某些活血化瘀中药抗心肌缺血实验结果相接近。同期动脉内皮损伤后内膜的增生研究显示,参元丹可抑制动脉内皮损伤后血管内膜过度增生,对血管内皮功能具有一定的保护作用。本研究