基于uplc-代谢组学技术评价大黄结合有氧运动对血脂异常大鼠血脂的调节作用

基于uplc-代谢组学技术评价大黄结合有氧运动对血脂异常大鼠血脂的调节作用

代谢组学是系统生物学的重要组成部分。包括疾病的诊断、药物作用机制、毒性、营利学、生物学、环境科学等领域。血脂异常是指各种原因导致的血浆中胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和(或)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)过高和(或)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低的一种全身脂代谢异常。运动和中药已成为是调节机体高血脂的有效方法。大黄(Rhubarb)是常用中药。具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄之功效。文献报道水煎液可增强小鼠血中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,使过氧化脂质(LPO)含量降低。醇提液能降低高胆固醇血症大鼠的血清TC、TG、载脂蛋白B、主动脉胆固醇的含量及动脉硬化指数升高HLD和载脂蛋白的水平。研究也显示醇提液具有降低血清TG、LDL-C、HDL-C的作用,并且具有保护肝细胞,降低脂肪变性程度,并抑制家兔血脂异常的作用。九制大黄蒽醌衍生物可使蛋黄及高脂饲料诱导的血脂异常的小鼠血清及肝脏TC、TG和LPO明显降低。此外,研究显示有氧运动对血脂代谢的影响是通过降低血浆中的TC、TG水平,促进TG的转运和降解,并且运动可能通过导致胆固醇逆相转运能力的增加,引起血液中HDL-C的升高和LDL-C的降低,使HDL-C/LDL-C比值升高,有利于外周胆固醇向肝脏中的转运和降解,从而促进了机体血脂代谢的改善,缓解心脑血管疾病的发生和发展。本文拟以UPLC-代谢组学与药效学方法,探讨大黄乙醇提取物结合有氧运动对实验性血脂异常大鼠脂质代谢紊乱的干预作用。1试验对象和方法1.1小组和大组健康雄性SD大鼠40只,随机分成5组(8只/组),正常组:正常食料喂养;血脂异常组:高脂饲料喂养;大黄组:高脂饲料喂养同时灌胃大黄提取物10g生药/kg·d;有氧运动组:高脂饲料喂养同时进行无负重游泳训练;大黄结合有氧运动组:高脂饲料喂养同时灌胃大黄乙醇提取物10g生药/kg·d,同时进行无负重游泳训练。在实验开始的第1天、第2周和第4周分别称体重,实验时间为4周。1.2大黄乙醇提取物大黄样品经过干燥、粉碎后,5kg用约10倍体积的95%乙醇浸泡24h后,开始渗漉,回收乙醇,重新利用。浓缩得棕色膏状物68g。1.3游泳训练游泳池为圆形,内壁光滑,直径45cm,水深70cm,水温30～35℃。大鼠每天无负重条件下游泳2h,周六、周日休息,共4周。1.4血清血脂指标检测在实验开始第第1天和第2周末对大鼠进行眼静脉丛取血,第4周实验结束,大鼠经腹主动脉采血,4℃,3000r/min离心10min,得上层血清。采用Olympus自动生化仪测定TC、TG、HDL-C及LDL-C等指标;采用试剂盒测定血清谷胱GSH-Px、SOD、MDA和过氧化氢酶(CAT)测定。1.5质谱条件:2.3%的苯甲酸水溶液b,2.2生长曲线2.美国Waters液相色谱仪;美国Xevo质谱仪;MassLynxV4.1工作站;HSST3色谱柱;流动相为0.1%的甲酸乙腈(A)-0.1%的甲酸水溶液(B);梯度洗脱程序:0～0.5min,1%B;0.5～3.5min,1%～35%B;3.5～7.0min,35%～99%B;7.0～8.0min,99%B;8.0～10.0min,99.0%～1.0%B;流速为0.45mL/min;自动进样器温度为4℃;进样量为2μL。质谱条件:ESI正离子模式;毛细管电压和锥孔电压分别为3.0kV和30V;干燥气流速800L/h;干燥气温度450℃。1.6统计学上的差异所有数据用M±SD表示,两组间差异比较,采用t检验,P<0.05表示统计学上存在显著性;P<0.01存在非常显著差异;P<0.001存在极显著差异。2结果2.1联合用药对血脂异常的治疗效果为了能够更加清晰地识别这种差异,通常采用化学计量学的方法,应用特殊的统计学软件,对大批量的数据进行聚类分析,在应用UPLC进行代谢组学的研究中通常使用的是主成分分析法PCA和偏最小二乘法PLS。这样经过软件的数据分类与特殊离群点的寻找可以发现不同组是否有差别。图1是第2周采用PLS-DA处理不同组间比较的结果,可以观察到单一大黄组介于正常组和模型组之间,但更接近与模型组(图1A);单一有氧运动组几乎与模型组没有差别(图1B);大黄结合有氧运动组介于正常对照组和高血脂模型组中间(图1C)。这些结果说明不仅大黄结合有氧运动组对血脂异常有一定的治疗作用,而且二者结合的治疗效果优于单一大黄组或有氧运动组。与第2周PLS-DA结果相比,第4周正常对照组、大黄组或有氧运动组或大黄结合有氧运动组、血脂异常模型组之间的距离增大,说明血脂代谢紊乱加重,推断造模成功。大黄组、有氧运动组、大黄结合有氧运动组均对血脂异常有一定的治疗作用,图2A显示可知单一大黄组接近正常对照组,图2B显示可知单一有氧运动组组接近于模型组,图2C显示可知大黄结合有氧运动组更近于正常对照组,说明单一大黄组的治疗效果优于单一有氧运动组,大黄结合有氧运动组治疗效果优于单一大黄组的治疗效果。整个实验阶段结果说明不仅大黄结合有氧运动组对血脂异常的有一定的治疗作用,而且二者结合的治疗效果优于单一大黄组或有氧运动组。2.2各组是否存在统计学上的显著性差异血脂异常模型组与正常对照组相比,在第0、2、4周体重均呈现增加的趋势,在第2周有氧运动组或大黄结合有氧运动组与模型组相比,存在统计学上的显著性差异;模型组与正常对照组、大黄组与模型组之间不存在统计学上的显著性差异;在第4周大黄结合有氧运动组与模型组相比,体重呈现下降的趋势,且存在统计学上的显著性差异,不同治疗组的体重变化接近与正常对照组(表1)。2.3对血脂异常模型大鼠hdl-c含量的影响TC、TG、LDL-C、HDL-C的变化在第2周和第4周的时间段,与正常对照组对比,血脂异常模型组的TC、TG和LDL-C都有较大的升高且存在统计学上的显著性差异、非常显著性差异或极显著性差异;第2周,大黄组和大黄结合有氧运动组的TC和TG存在显著性差异,有氧运动组与模型组相比TC存在统计学上的显著性差异,有氧运动组的TG、大黄组和有氧运动组的HDL-C不存在统计学上的显著性差异。第4周3个治疗组的TC、TG和LDL-C均存在显著性差异、非常显著性差异或极显著性差异(图3)。对于HDL-C第2周的结果而言,高血脂模型组与正常对照组相比,HDL-C有较大的降低且存在统计学上的非常显著性差异,但3个治疗组中仅大黄结合有氧运动组增加HDL-C含量且存在统计学上的非常显著性差异。第四周,与血脂异常模型组相比,大黄、有氧运动组、大黄结合有氧运动组都能升高HDL-C含量,且具有统计学上显著性差异或极显著性差异,且其升高HDL-C含量的效果以大黄结合有氧运动组的效果最为显著(图3)。上述的实验结果证明大黄、大黄结合有氧运动可有效抑制高血脂饮食大鼠血清TC、TG和LDL-C水平的升高,并提高HDL-C水平,联合作用的效果优于大黄单一作用,这些与代谢组学的结果一致。2.4种干预方式的血清gsh-px水平SOD、GSH-Px、CAT和MDA的变化4周实验,模型组与对照组相比,高血脂模型组的SOD和CAT降低且存在统计学上的显著性差异,单一大黄组或大黄结合有氧运动组与血脂异常模型组比存在统计学上的显著性差异,但有氧运动虽然有升高SOD和CAT的趋势,但不存在统计学上的显著性差异,模型组的血清GSH-Px水平显著下降且存在统计学上的极显著性差异,3种干预方式均显著升高血清GSH-Px水平。模型组的血清MDA水平显著升高且存在统计学上的非常显著性差异,大黄组和大黄结合有氧运动组干预可以显著降低血清MDA水平,而单纯的有氧运动则效果不显著(表2)。3对降脂治疗的作用中药“多组分、多靶点、整合调节作用”的特点及中医药理论的“整体观、动态观、辨证观”与代谢组学整体性、系统性、综合性相吻合。因此,以代谢组学为主体的系统生物学研究方法可能是现代科学中可以概括中医药抽象整体观思想的重要途径。病理过程中代谢网络的某些环节出现紊乱,该过程使生物代谢网络、使细胞产生的内源性产物的种类、浓度、相对比例发生扰动,这种扰动体现在小分子代谢产物集合轮廓的改变。因此通过比较正常组与模型组的代谢产物集合轮廓,可以从中得出两者内源性产物种类、浓度、相对比例是否处于相同范围,进而推断造模是否成功。PLS-DA在2周和4周的时间段显示,物质代谢紊乱不断加重,4周后血脂异常被成功的建立,这与用高脂食物喂养大鼠4周,使大鼠TC、TG等升高,体重增加,显示血脂异常症状一致。代谢组学已成为判断药理模型是否成功的新方法。代谢组学的图谱反映了不同治疗组治疗血脂异常的变化过程和改变的趋势,代谢组学结果说明不仅大黄结合有氧运动组对血脂异常的有一定的治疗作用,而且二者结合的治疗效果优于单一大黄组或有氧运动组。近年来,中医药的临床及实验性研究为治疗高脂血症积累了丰富经验,取得了很大的进展,已经发现中药材中降脂有效成分主要有皂苷、黄酮、生物碱、蒽醌、及脂肪油类等。关于治疗血脂异常的机制可能有以下几个方面:何首乌、草决明、虎杖、大黄等通过抑制机体对外源性脂类的吸收和TC转化物胆酸在肝肠循环中减少胆酸重吸收的数量从而达到降血脂效果;甘薯、枸杞、决明子、海带、大豆等通过阻断胆汁酸的肝肠循环,减少胆汁酸重吸收的数量,不仅增加胆汁酸及其衍生物的排泄量,还能过反馈机制增加胆汁酸合成限速酶活性,促进胆固醇转化为胆汁酸,从而达到降TC;绞股蓝总皂苷、大黄、香菇、阿魏通过抑制脂类的合成来起到降血脂作用;山楂、荞麦、银杏、黄芩通过抗过氧化来实现降血脂;南瓜、月见草、泽泻、姜黄、山楂通过提高HDL-C,降低VLDL-C、LDL-C水平来实现降血脂。大黄用于调节血脂的相关研究也有很多报导。大黄可使蛋黄及高脂饲料诱导的血脂异常的小鼠血清及肝脏TC、TG和LPO明显降低,其有效成分可能是蒽醌类、儿茶素类及多糖。研究表明大黄多糖有降低血清中TG、TC、LDL水平和升HDL水平和SOD活性,以及降低胰腺组织中多胺水平等作用;在高剂量大黄多糖的作用下,糖尿病动脉粥样硬化大鼠的血糖、TC、TG、LDL明显降低,血浆肝脂酶活性增加,所以大黄多糖能降糖、降血脂、增加糖尿病动脉粥样硬化大鼠血浆中肝脂酶的活性。大黄水煎液可显著增强小鼠血中SOD、GSH-Px活性,降低LPO的含量,而且这种作用在一定范围内随大黄用量增加而加强趋势。这说明大黄具有抗氧化的效果,其作用机制可能与其增加SOD、GSH-Px活性,使体内有毒的氧负离子得以清除,阻止其引起的自由基连锁反应,抑制脂质过氧化等作用有关。本实验发现大黄可以降低血清TG、TC、LDL-C,升高HDL-C,这与文献报导一致。掌叶大黄多糖具有升高衰老模型动物相关部位SOD、CAT、GSH-Px的活力、降低LPO水平的作用。临床研究显示大黄虫丸降低TC和TG,降低HDL,且与多烯康胶丸相比,存在统计学上显著性差异。本研究显示,大黄可以提高机体SOD和GSH-PX的活性,同时抑制MDA的产生,加快其清除,从而有效的防治机体的脂质过氧化反应,改善脂代谢紊乱的进展。可能的机制是大黄能促进肠道蠕动,加快胆固醇排泄,减少胆固醇吸收,从而起到降血脂、降低质代谢紊乱的作用。也可能是大黄中的儿茶酚胺能降低毛细血管的通透性,增加内皮的致密性,限制有害物质的进入,从而降低血黏度,减少脂质的沉积。大黄内含有蒽醌衍生物质,具有降血脂、扩血管的作用。本研究显示单纯有氧运动对GSH-PX的活性影响较明显,而没有降低血清的MDA含量和提高SOD和CAT的活力。单一的大黄取物仅仅能够上调SOD、GSH-Px和下调MAD含量,而对CAT没有明显的改变。然而