FD工艺对酱香型白酒堆积过程的影响

“FD工艺”对酱香型白酒堆积过程的影响

梁泺，范宏筠，税梁扬，张煜亮，周帅，李丽，冯治平,（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾644000；2.泸州国之荣耀酒业有限公司，四川泸州646000）酱香型白酒的工艺总结为“端午制曲，重阳下沙，一年一个生产周期，两次投粮，九次蒸煮，八次发酵，七次取酒”[1]，具有“高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒、生产周期长、储存周期长”四高两长的工艺特点[2]。酱香型白酒具有“酱香典型，细腻醇厚，空杯留香持久”的风味特征，深受消费者喜爱[3]。堆积发酵是酱香型白酒独有的生产工艺，堆积发酵过程是一个开放式过程，主要作用是富集周围环境微生物进行发酵，产生多种酶类并在多种酶类相互作用下合成酒体前驱物质及香味物质，为后续窖内发酵工艺提供重要微生物和酶类[4]。酒醅中酱香香气成分和风味物质前体来源于堆积发酵，这一过程被描述为“二次制曲”[4-5]，在高温条件下促成酯类等物质合成，产生典型的酱香香气[6]。因此，高温堆积过程对酱香型白酒的品质会带来深远的影响[6]。有报道称，没有堆积就没有酱酒，没有堆积更谈不上酱香风格，说明高温堆积是酱香型白酒的重要工序[7]。传统酱香型白酒堆积时间4～5d，当堆积酒醅温度达到46～52℃，微生物繁殖旺盛，再移至窖内进行发酵，保证发酵的正常进行。随着白酒酿造机械化进程的逐步推进，酱香型白酒机械化酿造过程中，机械设备对酒醅的物理特征的影响，加之气温较低的冬季环境下，其酒醅在堆积发酵环节易出现堆积酒醅升温不均匀和升温缓慢的问题。但是，温度直接影响酒醅微生物生长繁殖而影响各位点酒醅发酵状态，升温不均和升温缓慢则会导致酒醅发酵不彻底，影响酒质及产量。针对以上生产问题，对传统堆积模式进行改良，形成“FD工艺”，即当第一次酒醅堆积发酵温度达到43～45℃时，使用布氏抱斗对酒醅堆进行破堆、混匀、换位后，再进行收堆；使用布氏抱斗将堆子从顶部挖开，将顶部酒醅转移至旁边空地，并充分混匀顶部酒醅后形成底层酒醅，再将四周酒醅破堆，以同样的方式进行混匀后移至堆心层，将堆心层移至堆外层，遵循“面翻底，底翻面，中心翻四周”的原则，使各方位酒醅充分混匀后进行收堆再次堆积发酵至入池标准温度46～52℃时，即完成整个堆积发酵过程，可入池发酵。高通量测序技术又称第二代测序技术，它可以同时对数百万到10亿个DNA分子进行并列测序，同时满足多样本微生物的深度分析，其主要特点是高通量、快速、高精度、实时监测、数据信息量大等，可在极短时间内获得大量数据[8-9]。目前，高通量测序技术已被用于研究不同发酵食品中的微生物生态，如醋[10]和牛奶[11]，以及浓香、清香型、酱香型白酒中[12]。郭敏等[12]证实了高通量测序技术可用于酱香型白酒酿造发酵过程酒醅微生物多样性的研究。基于此，本文运用高通量测序技术对酱香型白酒堆积发酵过程中酒醅进行测序，分析细菌群落结构，以明确“FD工艺”对细菌群落结构的影响。较之传统堆积发酵工艺而言，“FD工艺”对堆积酒醅进行破堆、混匀、换位，重新引入微生物生长繁殖所需氧气，改善酒醅体系的溶氧水平，促使酒醅体系的微生物再次进行生长繁殖，优化和丰富酒醅体系的微生物群落结构，提升微生物的种类和数量，可使整个酒醅堆积温度均匀升高，降低酒醅堆不同空间区位的品温差异，从而改善酒醅的各项理化指标，促使整个堆积酒醅的均匀发酵，为酱香型白酒的发酵生香奠定基础。本研究以冬季的酱香型白酒第二轮次堆积发酵酒醅为研究对象，采用高通量测序技术分析堆积酒醅细菌群落结构，结合酒醅理化指标的动态变化，初步探究“FD工艺”对酱香型白酒堆积细菌群落结构变化，以及对酒醅在整个堆积阶段的发酵状态的影响，为“FD工艺”在酱香型白酒堆积过程的应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器酱香型白酒酒醅来源于泸州国之荣耀酒业有限公司；E.Z.N.A.®SoilDNAKitDNA抽提试剂盒美国Omega公司；酚酞、硫酸铜、盐酸、酒石酸钾钠成都市科隆化学品有限公司；氢氧化钠重庆川东化工有限公司；次甲基兰来自于天津市光复精细化工研究所；葡萄糖天津市致远化学试剂有限公司；FastPfu聚合酶北京全式金生物技术有限公司；所用试剂均为分析纯。DHG-9023A电热干燥箱上海琅歼实验设备有限公司；FA224X电子分析天平天津市德安特传感技术有限公司；450mm干燥器；WST数显温度计上海仪电科学仪器有限公司；ABIGeneAmp®9700型PCR仪美国ABI公司；DYY-6C电泳仪北京六一生物科技有限公司。1.2实验方法1.2.1酒醅取样方法本研究以冬季的酱香型白酒第二轮次堆积发酵酒醅为研究对象，同一车间相邻两个酒醅堆采用不同堆积发酵工艺。采用“FD工艺”酒醅为实验组，取样时间以收堆完成时开始计时（起始计为0h），取样时间间隔为24h，其中在71h时堆积酒醅温度达到43.4℃，达到“FD工艺”要求。71～72h进行“FD工艺”操作，进行再次堆积发酵至入池温度48.6℃，整个堆积发酵时间共持续至96h。取样时间编号F1、F2、F3、F4、F5。传统堆积发酵工艺即收堆完成后，经过96h自然堆积，酒醅温度升高至48.1℃，酒醅表层长满白色状菌丝，醅料中富集了大量微生物，并形成一定的酱香香气成分或风味前驱物，即完成整个堆积发酵。传统堆积发酵酒醅为对照组，同理取样时间依次编号为C1、C2、C3、C4、C5。取样点如图1所示，分别取堆子上层A点，中层B、C两点，下层D、E两点，取样后各层样品混匀再将上、中、下3个样品混合为1个样品，取样后迅速置于-80℃冰箱中保藏用于开展后续实验。图1堆积酒醅取样点示意图Fig.1Schematicdiagramofsamplingpointsforstackingfermentation1.2.2酒醅理化指标测定水分的测定参考GB5009.3-2016《食品中水分含量测定》中的直接干燥法进行测定。酒醅淀粉、酸度、还原糖含量的测定参考《白酒生产技术全书》[13]。1.2.3温度的测定使用数显温度计对堆子各采样点进行温度实时测定，测温记录点与采样时间保持一致，同一位点进行三次温度测定，取其平均值。1.2.4细菌群落分析使用E.Z.N.A.®SoilDNAKitDNA抽提试剂盒提取酒醅细菌总DNA，引物采用338F（5”-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3”）和806R（5”-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3”）[14]对细菌的16SrDNA的V3～V4区进行PCR扩增，扩增产物送送上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序和后续分析。基于默认参数，使用Qiime2流程中的DADA2插件对质控拼接之后的优化序列进行降噪处理。物种注释数据库：silva138/16s_bacteria，物种注释方法：bayes分类，置信度0.7，测序数据使用上海美吉生物有限公司的云平台（）进行在线数据分析。1.3数据处理采用SPSS26.0软件进行理化指标数据统计分析。使用Origin2019进行图片绘制，数据以表格及柱状图表示。2结果与分析2.1两组堆积酒醅理化指标的变化2.1.1堆积阶段酒醅水分含量变化水分是酱香型白酒生产过程中控制的关键工艺参数之一[15]，水分高低是判断发酵能否正常进行的依据之一。水分过高会使酒醅粘度升高，好氧型微生物生长受到抑制，厌氧型微生物加速繁殖，最终导致发酵酒醅出现酸败现象；水分过低则不利于糊化，且影响微生物正常生长，最终导致酒质受损[16-17]。堆积阶段酒醅水分含量变化如图2所示。图2堆积过程酒醅水分含量变化Fig.2Changesofwatercontentinfermentedgrainsduringstackingfermentation由图2中可知，实验组酒醅水分含量在52.0%～52.8%之间，对照组酒醅水分含量在51.7%～53.2%。两组样品在堆积发酵0～48h，酒醅水分含量表现出下降趋势，由于堆积温度处于上升过程，水分蒸发速度增加，酒醅中的水分处于一个自然流失状态；在堆积发酵48～71h，随着堆积时间的增加，温度升高，细菌进行大量生长繁殖代谢和淀粉的降解，产生部分水分，使得酒醅水分含量呈上升趋势。在72h时，实验组经“FD工艺”后水分含量明显下降。在72～96h时，受此时高温影响，传统堆积发酵酒醅水分含量呈下降趋势，而实验组酒醅经“FD工艺”后，大量引入氧气，微生物又一次富集，微生物再次进行生长繁殖代谢和淀粉降解，促使酒醅水分含量增加，且使整个堆积酒醅水分处于相对平衡状态。“FD工艺”能平衡酒醅堆各位点水分之间的差异，使得水分含量在整个堆积阶段变化幅度较小。整个发酵过程与李银强[17]和印璇等[18]研究结果基本一致，即酱香型白酒酿造过程中，发酵酒醅水分含量应保持在47%～56%，并且酒醅水分含量对酱香型白酒的生产有较大影响，应该严格控制酒醅水分含量。2.1.2堆积阶段酒醅酸度变化酸度是衡量堆积发酵后酒醅是否进入酒窖的主要依据之一；酸度过高或过低都会影响酒醅发酵状态，从而影响酒的产量和质量。为了保证白酒酒醅的固态发酵质量，酒醅酸度也是一个重要的影响因素，适宜的酸度能抑制杂菌的生长，为其他微生物正常生长提供良好的环境，同时能为各种酯类物质的合成提供前体[19]。印璇等[18]跟踪分析酱香型白酒酿造过程中的各项理化指标，认为酒醅酸度在1.5～2.2mmol/10g之间为适宜酒醅酸度。堆积阶段酒醅酸度变化如图3所示。由图3可知，对照组酒醅在堆积过程中，酸度呈现先上升后下降趋势。在堆积发酵前期细菌大量繁殖产酸，酒醅酸度缓慢上升；在堆积发酵后期，由于堆积温度升高，产酸微生物代谢受到抑制，且有机酸合成酯类等化合物中被消耗，酒醅中酸度呈下降。实验组在0～71h酸度呈上升趋势且上升幅度较大，在71h时，实验组达到3.05mmol/10g，显著（P＜0.05）高于对照组1.67mmol/10g。在经过“FD工艺”操作后，实验组酒醅酸度迅速下降至1.33mmol/10g；堆积到96h时，实验组酒醅酸度由1.33mmol/10g上升为1.54mmol/10g，对照组为1.59mmol/10g；两组酒醅达到适宜入窖酸度便可进行入池发酵。在堆积24～71h实验组酒醅酸度持续增加，由于该位点所采集的样品所处空间的某一方位酸类物质堆积过多所致，导致酒醅酸度持续增大；经“FD工艺”处理后，有效降低实验组酒醅酸度，达到适宜酸度1.59mmol/10g，符合酒醅入窖条件。由此可解决堆位点酸类物质在该点持续累积过多导致的酒醅酸败现象，说明“FD工艺”能够有效降低堆积酒醅酸度在某一方位持续增加，从而使得酒醅在各位点发酵状态基本一致。图3堆积过程酒醅酸度变化Fig.3Changesofacidityoffermentedgrainsduringstackingfermentation2.1.3堆积阶段酒醅淀粉含量变化淀粉是酿造过程中细菌生长繁殖的能量来源，也是生成酒精的主要物质，淀粉含量高低与出酒率呈正比[20]。堆积阶段酒醅淀粉含量变化如图4所示。图4堆积过程酒醅淀粉含量变化Fig.4Changesofstarchcontentinfermentedgrainsduringstackingfermentation由图4可知，在堆积发酵过程中，对照组酒醅和实验组酒醅随着堆积发酵时间的延长，酒醅中淀粉被微生物分解，淀粉含量下降。对照组酒醅淀粉含量从24.03%降至22.69%，淀粉含量下降了1.34%；实验组酒醅淀粉含量从24.93%下降至22.62%，淀粉含量下降了2.31%。在堆积71h后，实验组酒醅堆进行“FD工艺”处理，引入大量氧气，使堆积酒醅微生物再次富集，微生物的种类数量增多，微生物代谢活动增强，淀粉含量转化（或消耗）速率加快，说明“FD工艺”有利于淀粉转化。张春林等[20]对第二轮次堆积发酵过程中，随着发酵时间的延长，酒醅中淀粉含量逐渐下降，从27.88%降至24.73%；尚柯等[21]在第三轮次堆积发酵中淀粉测定结果在26.81%～31.96%之间，变化幅度较小，说明堆积过程重点是富集微生物，酒精发酵微弱。本研究淀粉消耗结果与张春林等[20]和尚柯等[21]结果基本一致，并且说明“FD工艺”有助于淀粉的转化。2.1.4堆积阶段酒醅还原糖含量变化发酵过程中还原糖含量的变化反映了糖化与发酵的协调程度[18]，酒醅中的淀粉及其他多糖物质会水解成可发酵性还原糖，供微生物代谢利用，后期发酵产香。堆积阶段酒醅还原糖含量变化如图5所示。图5堆积过程酒醅还原糖含量变化Fig.5Changesofreducingsugarcontentinfermentedgrainsduringstackingfermentation由图5可知，两组酒醅还原糖含量均呈上升趋势，与张春林等[20]研究发现的在酱香型白酒二轮次堆积过程中还原糖含量呈明显的上升趋势，含量从0.65%上升至1.00%，具有相同的上升趋势。酒醅还原糖含量主要在积累过程中增加。对照组酒醅还原糖含量从1.45%上升至2.19%，整体上升0.74%；实验组酒醅还原糖含量从1.71%上升至2.83%，整体上升1.12%。在72～96h，实验组经“FD工艺”处理后，还原糖含量从2.33%上升至2.83%，增加0.5%；对照组还原糖含量从2.13%上升至2.19%，增加0.06%。经过统计分析发现，实验组和对照组有显著差异（P＜0.05），即经“FD工艺”处理的酒醅其还原糖量显著高于对照组（P＜0.05），“FD工艺”有助于淀粉分解而形成酒醅中可发酵还原糖。本次研究所得结果实验组还原糖含量整体上升1.12%，对照组上升0.74%，远高于张春林等[20]的整体上升幅度（仅0.35%），淀粉在经“FD工艺”后氧气大量进入微生物生长繁殖加速消耗转变为还原糖，使得酒醅实验组还原糖含量明显高于对照组，满足酒醅中微生物的正常生长代谢，有助于各种微生物对还原糖的利用，进一步提升使酱香型原酒酒质[22]。2.1.5堆积发酵过程中温度变化温度是评价高温堆积成效的重要指标之一，当堆积酒醅温度达到48～50℃时进入窖池发酵，适宜的温度有助于酒体风味的形成和质量的提高[23]。堆积发酵过程中温度变化如图6所示。图6堆积发酵过程温度变化Fig.6Temperaturechangesduringstackingfermentation由图6可知，两组样品酒醅温度变化总体均呈上升趋势，均从收堆温度30℃左右逐步上升至50℃左右。其中，实验组在堆积71h时温度为43.4℃达到“FD工艺”温度指标要求，此时实验组进行“FD，工艺”处理，处理后实验组各层温度均匀混合，温度下降。在72h时两组样本数据达到显著（P＜0.05）水平，此时由于温度较低的堆心及堆底与温度较高的堆面和堆顶酒醅混合，加之外界冷空气的引入，导致实验组酒醅温度显著（P＜0.05）下降。随后在24h内迅速上升至48.6℃达到入窖温度，由于在处理过程中经过机械化破堆、混匀、换位，大量氧气进入酒醅，微生物的生长和新陈代谢所释放的热量使反应堆温度升高。在堆积96h两组样品酒醅堆积温度达到入池发酵温度，即可进行入池发酵。2.2细菌群落多样性分析2.2.1Alpha多样性指数Alpha多样性分析是分析微生物多样性的一个重要指标，用于研究某一生境内（或样本中）的群落多样性，可通过对一系列Alpha多样性指数进行评估，获得环境群落中物种的丰富度、多样性等信息。Shannon指数和Simpson指数是反映群落多样性（communitydiversity）的指标，Shannon指数越大说明微生物多样性越高；Simpson指数越大，微生物多样性越低；Coverage指数反映群落覆盖度（communitycoverage），Coverage指数越大，则样本中序列被测出的概率越高，该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况；Coverage指数接近1，说明测序数据足够大，可以反映绝大多数的细菌信息。Sobs指数、Ace指数、Chao指数是衡量细菌丰富度指标，指数大小与微生物丰富度呈正相关。酒醅细菌群落测序数据统计分析如表1。由表1可以看出酒醅样品的Ace、Sobs、Chao指数在逐步减少；在堆积过程中，由于温度不断上升，酒醅内部氧含量逐渐减少，微生物生长繁殖活动受抑制，一些不耐高温的菌经高温筛选后衰落凋亡。实验组样在堆积前4d和对照组酒醅样品的指标变化趋势大致相同，呈现下降趋势，在堆积最后1d，样品F5的酒醅细菌丰富度达到最大值。细菌群落多样性从Shannon指数和Simpson指数的变化可以反映出来，Shannon指数在两组样品中呈下降趋势，样品F5中Shannon指数最高，表明此时细菌多样性指数最大，种类越丰富。由表1可知，10个样本的Coverage指数均为1，说明本次测序深度基本能够覆盖酒醅中所有细菌群落。以上结果说明，酒醅经过“FD工艺”操作后，堆积酒醅重新引入大量氧气，打破堆积发酵的内部酒醅厌氧环境，并再次富集环境中的细菌类等微生物，促进细菌类等微生物大量生长和繁殖，并经过“FD工艺”处理后的酒醅再次堆积发酵，而温度急剧上升，再次进行高温，从而达到二次富集和筛选作用，最终使得有益于酿酒生产的细菌类微生物的丰富度、多样性显著提升。表1Alpha多样性指数Table1Alphadiversityindex2.2.2细菌群落组成成分分析优势细菌门水平变化规律两组10个样品中检测出了23个细菌门（图7），将相对丰度高于1%细菌门定义为优势菌门。两组样本在堆积发酵过程中，共检测到相对丰度高于1%细菌门，包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）三大门类（图7）。图7优势细菌门水平上变化规律Fig.7Variationofdominantbacteriaonthelevelofphylum变形菌门（Proteobacteria）被发现是酱香型白酒酿造过程中的主要细菌门[24]。变形菌门在对照组中呈现上升的变化趋势，占比分别为11.61%、42.34%、67.89%、52.42%和91.95%；在实验组样品中，堆积0～72h与对照组变化趋势相近，堆积72～96h有明显的下降，占比分别为55.62%、71.51%、88.21%、89.21%和41.17%（图7）。实验组在堆积第72h进行“FD工艺”处理后，F5中变形菌门（41.17%）占比明显低于对照组C5（91.95%），以上说明“FD工艺”不利于变形菌门的生长繁殖。厚壁菌门（Firmicutes）是中国白酒发酵过程中的关键微生物结构[25]。厚壁菌门在堆积过程中是呈下降的变化趋势（图7），对照组样品中堆积前期厚壁菌门占比达到81.53%，随着堆积时间逐渐下降，占比分别为55.06%、30.08%和45.15%，堆积最后1d下降至7.97%；实验组样品中的厚壁菌门在堆积前期与对照组同样呈下降趋势变化，占比为41.96%、27.55%、11.43%和10.64%，在实验组样品堆积第96h时，厚壁菌门占比为57.71%。通过样品C5（7.97%）和F5（57.71%）的对比可以看出，“FD工艺”能促进堆积酒醅中的厚壁菌门生长繁殖。放线菌在酱香型白酒中具有调控风味、抑制有害杂菌生长的作用[26]。放线菌门（Actinibacteria）在堆积过程中变化趋势总体下降，对照组C样品中的占比分别为6.64%、2.37%、1.98%、2.41%和0.08%；实验组F样品中的占比分别为2.38%、0.90%、0.35%、0.08%和0.37%（图7）。实验组样品在堆积96h放线菌门（0.37%）占比出现增长且大于对照组（0.08%），说明“FD工艺”能促进堆积酒醅中的放线菌门生长繁殖。优势细菌属水平变化规律两组10个样品中检测出了205个细菌属（图8），将相对丰度高于1%细菌门定义为优势菌属。两组样本在堆积发酵过程中，共检测到相对丰度高于1%细菌属包括醋酸杆菌属（Acetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、枝芽孢菌属（Virgibacillus）、克罗本斯泰亚菌属（Kroppenstedtia）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、火山渣芽孢杆菌属（Scopulibacillus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、驹型杆菌属（Komagataeibacter）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、NorankfPseudonocardiaceae、片球菌属（Pediococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、Unclassified_c_Bacilli。图8优势细菌属水平上变化规律Fig.8Changesofdominantbacteriaatthelevelofgenus芽孢杆菌（Bacillus）是酱香白酒中酱香风味物质的主要代谢菌属[27]，能分泌蛋白酶、淀粉酶等水解酶类，分解原料形成丰富的发酵前体物质，有利于风味物质的形成[28]。对照组样品中的相对丰度呈逐步下降趋势，由21.76%下降至1.49%，实验组样品在堆积0～72h和对照组样品变化趋势相同，从10.29%下降至2.43%；经过“FD工艺”处理后，堆积第96h芽孢杆菌相对丰度由2.43%上升至14.50%，上升幅度明显（图8）。样品F5（14.50%）较样品C5（1.49%）相对丰度高了13.01%，芽孢杆菌（Bacillus）相对丰度为14.50%，显著（P＜0.05）高于张春林等[20]得出的芽孢杆菌属的相对丰度（5.90%），以上说明“FD工艺”有利于芽孢杆菌生长，为芽孢杆菌的生长创造有利的有氧条件。枝芽孢菌属（Virgibacillus）对酱香型白酒风味品质的形成有重要贡献[29]。枝芽孢菌属（Virgibacillus）在对照组样品0～48h细菌群落占比总体呈下降趋势，相对丰度由21.03%下降至4.85%，第72h稍有上升，增至12.73%，96h下降至1.69%；实验组样品0～72h从8.77%下降至2.50%，经过“FD工艺”处理后，第96h枝芽孢杆菌属相对丰度由2.50%上升至11.85%，上升幅度明显（图8）。样品F5（11.85%）较样品C5（1.69%）相对丰度高了10.16%，说明“FD工艺”有利于好氧枝芽孢菌属的生长。鲜文东等[30]推测克罗本斯泰亚菌属（Kroppensted