小柴胡汤对lps热大鼠的作用

小柴胡汤对lps热大鼠的作用

“现代中医学”的概念自提出以来，人们对中药的提取和饮用方式产生了关注。传统的饮用水制备和食品复合体的冲饮剂被用来代替传统的饮用水制备。从制剂角度分析,颗粒配方与通常的饮片分煎后合并煎液比较接近,与传统的中药共煎是有所不同的。颗粒配方与中药合煎的化学成分是否相同,特别是药效是否接近,这是评价中药颗粒配方能否取代中药合煎的重要依据。虽然目前研究较多,但尚无定论。本课题以中医和解少阳的著名方小柴胡汤作为切入点,以本方现代临床多用于以发热为主症的各种疾病和药理研究具有退热作用为依据,从药效学角度,比较观察了小柴胡汤分煎合液与合煎液在退热作用方面差异,为认识中药颗粒配方的合理性提供实验依据。一、材料表面1.《五版教材》五版教材中药材:柴胡、黄芩、半夏、生姜、人参、甘草、大枣共7味药,购自北京同仁堂药店。小柴胡汤合煎与分煎合液的制备:小柴胡汤全方合煎液:小柴胡汤药味与剂量根据《方剂学》(五版教材)由柴胡12g,黄芩9g,半夏9g,生姜9g,人参9g,甘草6g,大枣12g组成。7味药材自来水浸泡40min,第1遍煎煮时加7倍的水,第2遍加5倍的水。每次煮沸后,控温电炉保持微沸30min。合并2次煎液,90℃水浴浓缩至100%浓度,使每1ml含原药材1g;分煎合液:小柴胡汤分成柴胡—黄芩、生姜—半夏、人参—甘草—大枣3组配伍药对,各药对组(依原方中各药剂量配伍)按上述水煎法分别水煎,2次煎液浓缩至100%浓度,冷却后按全方的配伍比例,配制为小柴胡汤分煎合液。2.华实验动物中心SD大鼠,雄性,体重220~250g,购自北京维通利华实验动物中心,合格证号:SCXK(京)2002-0003。室温(20±2)℃下分笼饲养,光照12h(AM8:00~PM8:00),实验前适应环境饲养1周。3.抗菌盐溶液配制纯化LPS(Escherichcacoliendotoxin055:B5,L2880,SigmaCo.)稀释于无菌生理盐水,配成20μg/ml的溶液,-20℃保存备用。4.仪器电脑数字型体温计,型号为MC-3B,欧姆龙(中国)有限公司生产。二、实验分组和处理1.实验分组大鼠每日测量体温(肛温)2次,连续2日,取两次体温的平均值记为基础体温。单次体温超过38℃或2次体温差超过0.5℃的动物剔除。将符合实验条件的大鼠54只随机分为7组:正常对照组,模型组Ⅰ组(LPS20μg/kg),小柴胡汤合煎Ⅰ组,小柴胡汤分煎合液Ⅰ组,模型组Ⅱ组(LPS80μg/kg),小柴胡汤合煎Ⅱ组,小柴胡汤分煎合液Ⅱ组。其中正常组大鼠6只,其余各组每组8只。2.动物处理及观察指标实验前6h禁食不禁水。模型组和给药组大鼠分别腹腔注射LPS(20μg/kg或80μg/kg),诱发动物发热;正常组注射生理盐水。造模的同时各中药组灌胃给与中药11g/kg体重(相当于人临床有效剂量的10倍),正常组和模型组给予同体积蒸馏水。注射LPS后每隔0.5h测1次体温,连续监测8h。3.数据处理绘制各组平均体温变化曲线;记录最大体温上升高度△T(发热时的体温与基础体温的差值)。各组数据用x¯±sx¯±s表示,多组数据采用方差分析(ANOVA)检验,组间比较采用q检验。全部数据使用SPSS10.0统计软件处理。三、结果1.小柴胡汤对t模型的影响与正常对照组相比,模型组在2.5h~5.5h间的7个时间点体温显著升高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,合煎组在0.5~5.5h的11个时间点的体温均显著降低(P<0.05,P<0.01);分煎组在2.5、3.5、4、4.5h的4个时间点体温均显著降低(P<0.05,P<0.01);合煎与分煎组组间比较,没有显著性差异。见表1。正常对照组△T波动不大,模型组△T曲线明显上移,且形成了较典型的二相发热曲线;与模型组相比,小柴胡汤合煎组的△T曲线明显下移,分煎组的△T曲线在2.5h后出现明显下移;小柴胡汤合煎组的△T曲线较分煎组下移。见图1。2.两组t、t呈不同的趋势与正常对照组相比,模型组在1h、2.5~4.5h、5.5h、6.5~8h共11个时间点体温显著升高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,合煎组在1~1.5h、3h、4h、5~8h的11个时间点均有显著性差异(P<0.05,P<0.01),分煎组在1、3、4、6.5~8h时有显著性差异(P<0.05,P<0.01);与分煎组比较,合煎组在0.5、5、6h均有显著性差异(P<0.05)。见表2。模型组是△T呈逐渐上抬趋势,6h后明显升高;而小柴胡汤合煎与分煎组的△T曲线均较模型组明显下移,分煎组在4~7h的△T曲线段较合煎组上抬。见图2。四、不同剂量致热模型的比较目前利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的动物发热是药理研究中最为常用的模型,作为无致热源非肠道药物的决定性试验被多部药典收录。LPS是革兰阴性细菌的内毒素(endotoxin,ET)的活性成分,呈高度水溶性,被认为是一种强力的外源性致热物质。大量研究表明,注射LPS能引起哺乳动物的体温升高,外周注射微量(0.02μg/kg)LPS就能够引起发热。LPS引起剂量依赖性发热,大鼠腹腔或静脉注射通常剂量10μg/kg~1000μg/kg的LPS可引起双相或三相热,降低剂量则表现单相热,反复注射后易出现耐受性。狗注射LPS(40,10,1,0.1,and0.01μg/kg),体温呈剂量依赖性升高。目前认为LPS引起发热是由LPS激活单核巨噬细胞,诱导其释放内生致热源(endogenouspyrogen,EP)所致。目前用LPS诱导发热模型所用LPS的剂量范围较大,从10μg/kg~250μg/kg不等,甚至1000μg/kg。其中较为常用的LPS剂量是10μg/kg、20μg/kg、100μg/kg。其中存在一个适宜剂量的选择问题,为此我们考察了二种不同剂量所致发热模型的特点。本实验观察到LPS按20μg/kg剂量腹腔注射,大鼠在注射后2.5~5.5h内体温显著升高(P<0.05,P<0.01);4h达峰值(38.5℃),最高增幅为1.15℃。按80μg/kg剂量腹腔注射,大鼠则在注射后的1h、2.5~4.5h、5.5h、6.5~8h共11个时间点体温显著升高(P<0.05,P<0.01);8h达峰值(38.8℃),最高增幅为1.65℃。表明本实验中所用的LPS两个剂量均能诱导出大鼠发热,但不同剂量诱导的发热模型在发热和峰值时间点以及持续时间的长短有所不同。通过分析比较,发现80μg/kgLPS腹腔注射引起的大鼠发热比20μg/kgLPS所致的发热热势高,持续时间长,利于观察。本实验还观察到,大鼠注射LPS剂量(20μg/kg、80μg/kg)所引起的大鼠发热也呈多相热,动物同时伴有恶寒、战栗、精神萎靡等症状,与小柴胡汤证中的“往来寒热”较为接近,提示该模型可能是研究中医少阳证的一个理想模型。曾有研究比较口服小柴胡汤各单味药分煎液与合煎液对酵母液所致大鼠发热模型的影响,观察到大鼠皮下注射20%酵母悬液10ml/kg后4h时出现体温升高,6h时体温达到峰值,小柴胡汤分煎液与合煎液(36.92g/kg和18.46g/kg)对皮下注射后4h、6h、8h共3个时间点的大鼠体温均有不同程度的降低作用,但组间没有显著性差异。本实验观察到,小柴胡汤按配伍药群的分煎合液与合煎液对两个剂量的LPS导致的大鼠发热均有显著的解热作用,且总体退热效用差异不明显,进一步表明小柴胡汤确有退热效用,而且解热药理作用下的分煎与合煎效用接近。但实验中也观察到,分煎合液与合煎液对不同剂量LPS所致模型呈现的解热效应有所不同。合煎液对20μg/kgLPS致热模型在注射LPS后0.5h即出现退热效应,退热作用持续5h;分煎液在注射LPS后2.5h出现退热效应,退热作用持续2h左右。对80μg/kgLPS大鼠发热模型的解热作用,分煎液出现在注射LPS后0.5h,合煎液出现在注射LPS后1h,在注射后8h内合煎液较分煎合液有更多的观察时间点呈现解热作用,并在5h、6h的解热作用显著优于分煎液。从两个发热模型的观察结果来看,小柴胡汤合煎液的解热作用起效均较快,解热作用的持续时间较长,表明小柴胡汤分煎与合煎的解热作用同中有异。实验结果提