气相色谱分析

第二章气相色谱分析

§2-1气相色谱法概述

色谱法(chromatography)：以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：（stationaryphase）

管内保持固定、起分离作用的填充物。流动相：（mobilephase）流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。

按固定相的几何形式分类：

1.柱色谱法，

2.纸色谱法，

3.薄层色谱法。按两相所处的状态分类 ：

气相色谱法液相色谱法气-固色谱法液-固色谱法气-液色谱法液-液色谱法

气相色谱仪通常由五部分组成：Ⅰ载气系统：气源、气体净化器、供气控制阀门和仪表。Ⅱ进样系统：进样器、汽化室。Ⅲ分离系统：色谱柱、控温柱箱。Ⅳ检测系统：检测器、检测室。Ⅴ

记录系统：放大器、记录仪、色谱工作站。国产气相色谱仪

皂膜流量计转字流量计调整仪，标准仪SetupofGasChromatograph

图1、色谱过程图2、色谱图ABKA>KB

色谱图（chromatogram）：

试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，色谱图界面

常用术语：基线：在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。峰高与峰面积：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peakheight)。用h表示。峰与峰底之间的面积称为峰面积(peakarea)，用A表示。峰的区域宽度：

a、峰底宽WD=4σ=1.70Wh/2b、半高峰宽Wh/2=2.355σc、标准偏差峰宽W0.607h=2σ

保留值:

1)保留时间

：从进样至被测组分出现浓度最大值时所需时间tR。

2)保留体积：从进样至被测组分出现最大浓度时流动相通过的体积，VR。

死时间：

不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时所需的时间称为死时间(deadtime)，tM。死体积:

不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时流动相通过的体积称为死体积(deadvolume)，VM。（F0为柱尾载气体积流量）

VM=tM

F0

调整保留值:

1)调整保留时间：扣除死时间后的保留时间。

tR׳=tR–tM

2)调整保留体积：扣除死体积后的保留体积。

VR׳=VR–VM

或VR׳=tR׳F0相对保留值（relativeretention）在相同的操作条件下，待测组分与参比组分的调整保留值之比，用ri，s

表示

色谱分析的实验依据：１、根据色谱峰的位置（保留时间）可以进行定性分析。

2、根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量分析。

3、根据色谱峰的展宽程度，可以对某物质在实验条件下的分离特性进行评价。由此可知：相对保留值应该与柱长、柱径、填充情况、流动相流速等条件无关，而仅与温度、固定相种类有关。当ri，s=1时两个组分不能分离。

§2-2气相色谱分析理论基础一、分配平衡的几个参数：1、分配系数（distributioncoefficient）

在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相间达到分配平衡时的浓度比值，用K表示。

。2、容量因子（capacityfactor）

在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的质量比，称为容量因子，也称分配比，用k表示。

cs、cm分别为组分在固定相和流动相的浓度(g/ml)；Vm为色谱柱中流动相的体积，近似等于死体积，Vs为色谱柱中固定相的体积。

3、分配系数和分配比之间的关系

分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。

理论上可以推导出：

Phaseratio(相比，b):VM/VS,反映各种色谱柱柱型及其结构特征填充柱（Packingcolumn）:6~35毛细管柱（Capillarycolumn）:50~1500色谱过程的基本方程式：

二、色谱分离的基本理论

1、塔板理论（MartinandSynge1941）塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则

H=L/n式中n为理论塔板数。理论塔板数（n）可根据色谱图上所测得的保留时间（tR）和峰底宽（w）或半峰宽（wh/2

）按下式推算：或有效塔板数（neff）的计算公式为；通常用有效塔板数（neff）来评价柱的效能比较符合实际。neff越大或Heff越小，则色谱柱的柱效越高。

Heff=L/neffn=1+kk2•neff

2、速率理论（J.J.VanDeemter

1956）

速率理论认为，单个组分粒子在色谱柱内固定相和流动相间要发生千万次转移，加上分子扩散和运动途径等因素，它在柱内的运动是高度不规则的，是随机的，在柱中随流动相前进的速度是不均一的。

A项为涡流扩散项；B/u项为分子扩散项；Cu为传质项，；u为载气线速度，单位为cm/s。范第姆特方程式(VanDeemterequation)

StationaryphaseStationaryliquidCapillarywall

§2-3色谱分离条件的选择一、分离度（resolution）

相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度平均值之比，用R表示。分离度可以用来作为衡量色谱峰分离效能的指标。

★R越大，表明两组分分离效果越好★保留值之差取决于固定液的热力学性质★色谱峰宽窄反映色谱过程动力学因素及柱效能高低

对于峰形对称且满足正态分布的色谱峰：R=1,分离程度为98%；R=1.5，分离程度可达99.7%。所以R=1.5时可认为色谱峰已完全分开。

二、色谱分离关系式 设两相邻峰的峰宽相等，即w1=w2，则

又知另称为柱效项；称为柱选择项；容量因子项。相对保留因子

与柱效的关系（柱效因子）与容量因子的关系

R∝n1/2增加柱长减小塔板高度限制：L过长，保留时间延长，分析时间延长，色谱峰扩展。使用性能优良的色谱柱，并选择最佳分离条件k值增大，有利于分离，但k>10时，对R的增加不明显，也会显著增加分析时间k的最佳范围：1~10

与柱选择性的关系分离度、柱效、柱选择性的关系

r2,1越大，柱选择性越好，分离效果越好。如果两个相邻峰的选择因子足够大，则即使色谱柱的理论塔板数较小，也可以实现分离。L=16R2•H有效aa-12=n有效•H有效

例题：设有一对物质，其r2,1=α=1.15,要求在Heff=0.1cm的某填充柱上得到完全分离，试计算至少需要多长的色谱柱？解：要实现完全分离，R≈1.5,故所需有效理论塔板数为：

使用普通色谱柱，有效塔板高度为0.1cm,故所需柱长应为：

三、色谱条件的选择 1、载气流速的选择（与分析时间、柱效有关）

实际工作中，为了缩短分析时间，常使流速稍高与最佳流速。

2、分离柱型的选择（与总柱效、分离度R有关）

3、柱温的选择（与ri，j有关）

能使沸点最高的组分达到分离的前提下，尽量选择较低的温度。当然被测物的保留时间要短、峰形不能有严重拖尾。最好用程序升温方法，以实验优化选择的条件为工作条件。4、固定液与担体的选择（与相比有关）由实验手册查出参考值，再由实验选择。5、汽化室与检测室温度（与被测对象的利用度有关）汽化温度、检测室温度高于柱温30-70度。6、进样量：（与柱容量有关）根据担液比及柱子形式决定进样量，进样方式为柱塞进样。

§2-4固定相及其选择一、固定相的类型：吸附剂型固定相

固定相{

担体+固定液型固定相常用吸附剂型固定相有：

常用担体+固定液型固定相中：常用担体有：1、红色担体：（101型担体）

特点是：表面空隙小、比表面积大、机械强度高、担液能力强、表面有吸附中心。2、白色担体：（6201型担体）

特点是：表面空隙较大、比表面积较小、机械强度较差、担液能力中、表面无吸附中心。3、非硅藻土型担体：聚合氟塑料担体、玻璃微球担体、高分子微球担体等。

特点是：表面空隙适中、比表面积适中、机械强度较强、耐高温、耐强腐蚀、价格偏高。硅藻土型担体用前要预处理：酸洗、碱洗、硅烷化。

二、固定液的类型：

三、固定液的极性：

固定液与待测化合物之间的作用力主要属定向力、诱导力、色散力、氢键力等弱相互作用为主，所以固定相的极性对分离过程非常重要，固定相极性用相对极性P的公式表示：规定：β,β’-氧二丙腈固定液的P=100、角鲨烷固定液的P=0、测试标样为环己烷-苯

按P的数值将固定液的极性以20间隔分为五级：

0~20为0~+1，称非极性固定液；

20~40为+1~+2，称弱极性固定液；

40~60为+2~+3，称中极性固定液；

80~100为+4~+5,称强极性固定液；

固定液的极性与待测组分极性的选择原则为：

“相似相溶原理”

四、固定液选择示例

§2-5气相色谱检测器一、气相色谱检测器的类型

气相色谱检测器根据响应原理的不同可分为浓度型检测器和质量型检测器两类。浓度型检测器：测量的是载气中某组分瞬间浓度的变化，即检测器的响应值和组分的瞬间浓度成正比。如热导池检测器（TCD）和电子捕获检测器（ECD）质量型检测器：测量的是载气中某组分质量比率的变化，即检测器的响应值和单位时间进入检测器的组分质量成正比。如氢火焰离子化检测器（FID）和火焰光度检测器（FPD）

通用检测器有：1、热导池检测器，TCD(Thermalconductivitydetector)

测一般化合物和永久性气体2、氢火焰离子化检测器,FID

(Hydrogenflameionizationdetector)测一般有机化合物专用检测器有：3、电子俘获检测器，ECD(Electroncapturedetector)测带强电负性原子的有机化合物4、火焰光度检测器，FPD(Flamephotometricdetector)测含硫、含磷的有机化合物特殊检测器有：FTIR、MS、测化合物结构

二、气相色谱检测器的工作原理1、热导检测器

原理；就是利用不同的物质具有不同的导热系数。Self-study&Exam:

热导池的构造，工作原理及影响检测灵敏度的因素。

2、氢火焰离子化检测器原理：利用有机化合物在氢火焰中燃烧时能产生带电离子碎片，收集其荷电量进行测定。 Self-study&Exam:

氢火焰检测器的构造，工作原理及影响检测灵敏度的因素。

三、色谱检测器的灵敏度1、灵敏度

2、最小检出量3、响应时间4、线性范围5、噪音及检处出限

§2-6气相色谱定性法一、利用内标物与待测物的相对保留值r1，2

进行定性分析。实验中要用双柱、或多柱进行分析，必须要有适当的标准物质。二、利用保留指数进行I进行定性分析

Xz+1

，Xz

分别代表含Z+1、Z个碳原子的正构烷烃在测定柱上的调整保留参数，Xi代表待测物质在测定柱上的调整保留参数。由于I的值温度之间呈线性关系，所以可以方便的外推求出文献测定条件下的I

值而进行定性分析，无须标准物质。 ITCABX1•••X2•

n-heptane:

n-octane:FigureSketchmapfordeterminationofrotentionindex

§2-7气相色谱定量法一、色谱定量公式：

mi=fi′•Aimi

：待测物质质量fi

′

：待测物质定量校正因子Ai

：待测物质色谱峰的积分面积

二、色谱峰的面积求法：1、峰高乘半峰宽法 2、峰高乘平均峰宽法3、峰高乘保留值法4、电子积分法

三、定量校正因子

（Quantitativecalibrationfactor）

绝对校正因子：相对校正因子：用标准物质为参照物、求出待测物质与标准物之间绝对校正因子的比值。对热导池检测器的标准物是苯、对氢火焰离子化检测器的标准物是正庚烷。

1.质量校正因子（Masscalibrationfactorfm）

2.摩尔校正因子（MolarcalibrationfactorfM

）

各物质的量以摩尔数计，Mi,Ms分别表示被测物与标准物质的相对分子质量（摩尔质量）

四、定量计算方法1、归一化法：若样品中所有的组分均能流出色谱柱且有较好的、可分辨的色谱峰时可用此法定量。

2、内标法：若样品中除待测的几个色谱峰有良好分离，但其它所有的组分不能全部流出色谱柱或有不可分辨的色谱峰时可用此法定量。

3、内标标准曲线法：若样品用量与加入标准物质量完全固定，则内标法的计算就可以简化为内标标准曲线法，它适用于工厂内成批样品的定量分析。如果经常需要测定同一物质，可固定试样的称取量，并加入恒定量的内标物，此时fi

mS

/fs

m为一常数故：

wi∝Ai/ASFigureInternalworkinggraph适合于液体试样的常规分析

2、外标法：所谓外标法就是应用欲测组分的纯物质来制作标准曲线。此时用欲测组分的纯物质加稀释剂(对液体样品用溶剂稀释、气体样品用载气或空气稀释)配成不同含量(％)标准溶液，取固定量标准溶液进样分析，从所得色谱图上测出响应讯号(峰面积或峰高等)、然后绘制响应信汛号(纵坐标)对百分含量(横坐标）的标准曲线。分析试样时，取和制作标准曲线时同样量的试样(固定量进样)，测得该试样的响应讯号，由标准曲线即可查出其百分含量。

SignalwiAiwi

§2-8毛细管气相色谱法一、毛细管柱型：

1、壁涂开管柱

2、多孔层开管柱

3、载体涂渍开管柱

4、化学键合毛细管柱

5、交联毛细管柱二、毛细管柱的特点：

1、渗透性好，柱压降小，可用长柱型

2、柱容量小，允许进样量小，进样必须分流

3、总柱效高，可分离复杂物质体系

4、相比大，可以快速分析。

三、仪器特点：分流器和尾吹气装置 毛细管柱

§2-9气相色谱法的应用

Self-study&Exam

p59~p60作业：2、4、6、15、20、21、

23、25、28、32。

高效液相色谱法：

特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105Pa

高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）第三章高效液相色谱分析法HPLC

（HighPertormanceLiquidChromatography，）§2-1

高效液相色谱法的特点

一、HPLC与GC差别

1．分析对象的区别

GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。

HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置二、高效液相色谱仪流程图三、HPLC的特点和实际应用1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂体系中的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等）3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。§2-2

基本理论和条件选择基础理论热力学理论：塔板理论——平衡理论动力学理论：速率理论——Vander方程一、塔板理论1.二、速率理论（与GC对比）2）涡流扩散项及其影响2.讨论：

1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）3）传质阻抗项及其影响1．三、影响分离的因素1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min

3.柱温的选择：选室温250C左右四、HPLC法中分离条件的选择一、液固吸附色谱法（LSC）

(liquid-solidadsorptionchromatography)二、液液分配色谱法（LLC）

(liquid-liquidpartitionchromatography,chemicalbondedphasechromatography三、离子色谱法（IC）（ion-exchangechromatographyandionpairchromatography)四、空间排阻色谱法（SEC）（stericexclusionchromatography§2-3

各类高效液相色谱法简介1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异

分离前提：K不等或k不等一、液固吸附色谱法（LSC）

流动相为液体，固定相为固体吸附剂2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104

球形YQG3~4μm8×108

堆积硅珠YQG3~4μm8×108

理想

原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物3．流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂

例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑

溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，

tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量>17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用

固定液——极性→NLLC

固定液——非极性→RLLC3．正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC）

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分

反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分二、液液分配色谱法（LLC）（一）常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面

1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）

2．特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱4、化学键合固定相（二）反相键合相固定相1．分离机制：疏溶剂理论正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑，k↑，组分tR↑

反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，

k↓，组分tR↓2．固定相：极性小的烷基键合相

C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性>固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）

例：水+甲醇，乙腈，THF4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小（同LSC）

底剂+有机极性调节剂

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等1．反相离子对色谱法（IPC或PIC）

反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分