未折叠蛋白与炎症性肠病

未折叠蛋白与炎症性肠病

炎症肠疾病（ibd）包括溃疡性胃炎（tc）和克罗恩病（cd）。这是一种早期和未完全确定病因的肠慢性炎症疾病。近年来,我国临床诊治数量明显增多。有证据表明,肠上皮细胞(IEC)缺陷导致的肠黏膜屏障损伤是IBD的重要病因。其中,IEC内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)导致肠黏膜屏障功能受损,继而参与IBD患病,更是倍受关注。1pro生产非负局部治疗的ers作为细胞内最大的膜网络结构,内质网(ER)担负着蛋白质修饰、加工以及新生肽链的折叠、组装和运输的重任,且为细胞内Ca2+的贮存场所。多种应激因素(病原微生物、营养底物缺乏、脂肪超载、炎性因子、缺血缺氧等)均可造成未折叠或错误折叠蛋白在ER内蓄积以及Ca2+平衡紊乱,引发ERS。ER腔内的重要分子伴侣GRP78(又称为BiP)协助新生蛋白正确折叠,ERS时表达增加,可视为ERS的标志蛋白。由ERS引发的真核细胞为减轻其而激活的一系列自身保护机制则称为未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse,UPR)。目前,已知的感知ERS并启动UPR的主要分子包括IRE1α、PERK和ATF6等。ERS时,上述分子与GRP78解离,并活化。IRE1α活化后将转录因子XBP1的mRNA(Xbp1u)移码剪接成为具有活性的Xbp1s,继而激活一系列UPR靶基因转录,减轻ERS。量化Xbp1s是判断ERS的有效指标。PERK活化后则磷酸化eIF2α(p-eIF2α),导致蛋白翻译无法启动,缓解内质网负荷,并激活UPR靶基因如ATF4等。ATF6活化后转移至高尔基体,经特异切割后释放活性片段ATF6f,转移至细胞核,并激活UPR靶基因转录。UPR的主要效应有:①上调分子伴侣(如GRP78)表达,以促进未折叠蛋白折叠;②抑制新蛋白质合成,以减轻负荷;③通过内质网相关降解作用(ERAD),降解未折叠或错误折叠蛋白。当上述效应仍无法缓解蛋白折叠缺陷并恢复内质网稳态时,ERS将启动细胞凋亡(apoptosis),以清除产生缺陷蛋白的细胞。CHOP、JNK和caspase-12通路是ERS诱导凋亡的三条主要途径,其中以CHOP途径最为重要,而caspase-12途径则是其特定的凋亡途径。ERS时,caspase-12发生特定位点裂解,活化并激活caspase-9和caspase-3,介导细胞凋亡。需指出,UPR途径通过相关信号间的“互话”平衡,对细胞转归至关重要。ERS是一种广泛存在的病因机制,可参与多种疾病的病程。而针对ER的保护剂,化学或药物分子伴侣,如苯基丁酸(PBA)或牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA),能稳定蛋白质的合成,增强ER折叠功能和促进突变蛋白的转运,并在ERS相关疾病(如糖尿病)治疗中,显示出潜在应用前景。2ire1-/-小鼠肠道行为的核心产物—UPR途径异常与黏膜屏障损伤肠黏膜上皮细胞(IEC)是代谢最为旺盛的细胞群之一,具有发达的内质网结构。同时,IEC受到肠腔共生菌群、黏膜炎性介质等ER应激原的持续作用。在4种IEC中,Paneth细胞和杯状(Goblet)细胞的蛋白分泌功能最强,也最易受到ERS的影响。UPR途径正常功能的发挥对维持IEC的ER稳态极其重要,一旦出错,就可能导致ERS和黏膜屏障损害。Kaser等首次揭示了肠上皮UPR途径缺陷可引起黏膜屏障损害和IBD。他们发现,肠道上皮条件性敲除Xbp1基因的小鼠可以产生类似于人类IBD的回肠炎,且纯合子(Xbp1-/-)和相当一部分杂合子(Xbp1+/-)小鼠都会出现上述改变。与之相应,Xbp1-/-的IEC出现ERS,表现为grp78和Atf4转录增加等。一方面Paneth数量和分泌抗微生物肽(如α防御素)能力受损;另一方面杯状细胞因凋亡减少近30%。XBP1缺陷时,IEC对炎性介质(TNF-α)或共生菌群产物(如Flagellin)更为敏感,更易引起JNK过度活化和趋化因子CXCL1分泌增加,导致自发性回肠炎,并对DSS结肠炎易感性增加。故而,ERS途径不仅可影响肠道上皮的抗微生物能力,而且还能影响IEC对共生菌群和炎性介质的敏感性。所以,IEC能自主调节其对共生菌群和炎性环境的反应性,但当反应达到一定程度时就会引起肠道炎症。IRE1基因包括IRE1α和IRE1β。IRE1β-/-小鼠肠道GRP78和磷酸化p38表达均增加,提示IRE1β缺失可导致ER功能缺陷。与野生型或IRE1β+/-小鼠相比,IRE1β-/-小鼠在DSS处理后的结肠炎更重,并且反映肠道炎性标志物ICAM-1出现提前。相反,阻断ERS凋亡途径,能减轻甚至阻断IBD的发生。CHOP是一种转录因子,主要参与ERS诱导的细胞凋亡过程。CHOP缺失小鼠能抵抗DSS结肠炎,GRP78表达水平也低于野生型小鼠。新近一项研究也支持ERS与肠黏膜机械屏障破坏的密切关系。针对HIV的蛋白酶抑制剂能诱导IEC的ERS,并继发IEC凋亡增加、黏膜屏障削弱。阻断CHOP后,可减轻黏膜屏障破坏的程度。由此可见,ERS和UPR激活能介导外来刺激导致的黏膜机械屏障受损。3有效控制两菌株亚单位的累积杯状细胞可分泌黏液糖蛋白(如MUC2等)和大量可溶性防御因子(如RELMβ)是肠化学屏障的重要组成部分。这种强大的分泌功能无疑给杯状细胞的ER造成极大负担。当各种原因导致未折叠蛋白过度产生和蓄积时,就很容易产生ERS引起炎症,甚至凋亡。MUC2需在ER中完成亚单位折叠及修饰。当基因突变导致MUC2蛋白装配错误并在ER蓄积时,小鼠表现为杯状细胞中黏液贮存减少和肠上皮黏液层消失,并有ERS存在,即grp78上调、Xbp1mRNA剪切增加和细胞凋亡增多等。但当杯状细胞完全缺失时,则无自发性或诱发性肠炎,说明MUC2蛋白发生错误折叠时,不仅引起黏液层缺失和肠腔共生菌群与上皮直接接触增加,可能还涉及到错误折叠蛋白在细胞内积聚,导致ERS后继发的促炎作用,引起肠炎。4il-10-/-小鼠和tnf-肠道菌群和炎性因子等因素影响IBD发生的病因可能与调控上皮ERS有关。与IBD相关的一个关键驱动因素是肠腔菌群,这是肠黏膜生物屏障的主体。有证据提示,肠腔微生物可能直接或间接调节UPR通路,诱导或抑制肠道炎症。如链霉菌以产生“trierixin”毒素,抑制XBP1活化。产志贺毒素大肠杆菌中也有一种叫做AB5的强力细胞毒素,破坏GRP78功能而激活ERS。感染小鼠后其IEC中的UPR与Xbp1/小鼠极为相似。这些研究都显示了肠腔微生物可产生调节上皮UPR的因子。IL-10是重要的抑炎和黏膜屏障保护因子。IL-10-/-小鼠是经典的共生菌群依赖的IBD模型。共生菌群刺激可使IL-10-/-小鼠IEC中GRP78表达上调,而在野生型小鼠则不会发生这种情况,提示IL-10能抑制共生菌群诱导的肠道上皮ERS。IL-10缺失时,上调的GRP78使促炎介质产生增多,甚至可诱发细胞凋亡。TNF-α是肠黏膜中最重要的致炎因子之一,针对TNF-α的单克隆抗体(如Infliximab)已广泛应用于临床IBD的治疗。TNFARE/WT小鼠因删除了TNF-α基因上游特定区域,增强了其mRNA稳定性,TNF-α产生增加,可引起严重的回肠炎。蛋白质组学分析表明,TNFARE/WT小鼠的IEC中延胡索酰乙酰乙酸酶(FAH)表达下降,导致FAA(fumarylacetoacetate)积聚。而体外实验已表明,FAH下调和FAA积聚可诱导ERS,包括grp78表达增加、eIF2α磷酸化(p-eIF2α)、促凋亡途径CHOP和caspase-12活化等。5ers与自噬基因Cadwell等发现,自噬(autophagy)基因Atg16l1次形态突变的Paneth细胞存在超微结构改变和炎性基因表达异常,在ATG16L1纯合子突变的CD病人也有类似的改变。全基因组关联研究(Genomewideassociationstudies,GWAS)证实,ATG16L1与人类CD有着极强的相关性。另一个自噬基因IRGM也与CD关系密切。这提示肠上皮细胞的自噬过程在黏膜屏障的维护和防止IBD发生中发挥作用。ERS与自噬,这两种IBD的危险因素都在Paneth细胞中汇聚,人们自然会联想到上述通路之间是否会存在关联。实际上有证据提示,ERS可能是自噬的启动因素,可能的纽带是IRE1。ERS诱导自噬的通路可能为IRE1-TRAF2-JNK途径。TRAF2缺陷和JNK阻断剂都可阻断ERS诱导剂诱导的自噬小泡积聚。IRE1的过度活化是XBP1功能不全的重要特征。而IRE1的活化可能使细胞启动自噬过程适应ERS而不至于发生凋亡。这可能在Xbp1+/-小鼠或XBP1次形态突变的IBD病人中尤为重要。与Xbp1-/-小鼠因细胞凋亡导致Paneth细胞缺失不同,Xbp1+/-小鼠虽有肠道炎症和Paneth细胞功能不全,但无细胞数量减少,可能系JNK活化的程度不足以引起细胞凋亡,但可引起其他适应性改变,以应对ERS(如自噬)。在ERS细胞中,活化的IRE1可根据需要,作出凋亡抑或自噬的选择。6性别民警对新型口周皮细胞的激活作用在IBD病人的小肠和结肠中,都能检测到Xbp1剪切增加和ERS的存在。对超过1000例IBD病人进行基因组分析后发现,在5个非同义SNP(nsSNPs,可导致XBP1氨基酸序列改变)中,4个仅出现在IBD病人。研究人员对其中两个IBD特异性的snSNP(M139I、A162P)进行分析发现,存在这两个SNP的IEC的UPR功能显著降低。鉴于在Xbp+/-上皮中,XBP1表达下降50%,就能引起IRE1的强烈活化,可以预测,在携带高危位点的XBP1位点突变人群中,XBP1功能的轻度下降就可引起显著后果。Heazlewood等观察到,在UC病人IEC的细胞质中,MUC2前体的积聚和杯状细胞超微结构的改变,并伴grp78表达增加,提示存在ERS。由于尚未发现Muc2基因多态性与人类IBD相关,故UC时的ERS可能继发于炎性反应或由于UPR途径(如XBP1)原发异常造成。Shkoda等发现,在CD、UC和非IBD的炎性肠病病人中,肠上皮细胞grp78表达增加程度是类似的。故当前的临床研究显示,上皮ERS既可作为肠道炎症的启动因素,也可成为肠道炎症的结果。可以预测,那些由于遗传易感性而无法恰当处理ERS的个体,不仅会因肠道上皮ERS的缺陷启动肠道炎症,而在炎症开始后,会因炎性反应诱导的ERS而加剧。7ers在染色体上的地位IEC作为具有高度分泌功能的细胞之一,极易受到ERS的影响。肠上皮XBP1缺失可引起IRE1过度活化,激活下游JNK等通路,引起Paneth细胞和Goblet细胞数量减少和功能障碍。已知Xbp1在染色体上的定位处含IBD易感的基因多态性,说明ERS是与肠道乃至其他器官炎症有关的