新高考生物通用版总复习一轮课件选修3专题14基因工程生物技术的安全性和伦理问题

选修3现代生物科技专题[思维网络]专题1、4基因工程、生物技术的安全性和伦理问题[考情分析]

考点一1.限制性核酸内切酶DNA重组技术的基本工具

[考点梳理]

(1)来源：多数来自____________。

(2)作用特点。 ①主要切割外源DNA，而对自身的DNA不起作用，达到保护自身的目的。 ②专一性：只能识别DNA分子中特定的核苷酸序列，且只能在每一条链中特定的部位进行切割。原核生物

(3)识别序列的特点：限制酶识别的序列大多数为________结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。(4)作用结果——黏性末端和平末端。①黏性末端：是限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的(错位切)，如下图所示：回文对称②平末端：是限制酶在识别序列的中轴线切开时形成的(平切)，如下图所示：磷酸二酯键

(5)作用实质：使特定部位的两个核苷酸之间的__________断开。限制酶选择的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoR

Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。2.DNA连接酶拼接成新的(1)作用：将限制酶切割下来的DNA片段_____________________________。大肠杆菌黏性末端(2)类型。黏性末端和平末端磷酸二酯键DNA分子(3)DNA连接酶和限制酶的关系。3.载体(1)条件。携带外源DNA片段进入受体细胞[易错诊断]1.DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。()答案：×2.E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。((

)答案：×3.每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶切割位点。

)答案：√4.质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(

)答案：√5.切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核)苷酸序列。(

答案：×[基础测评]1.下列属于“分子缝合针”的是()③DNA聚合酶②DNA连接酶

B.①② D.②④

①E.coilDNA连接酶④解旋酶 ⑤RNA聚合酶

A.①②③ C.①②⑤

答案：B2.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是()

A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒

B.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶

C.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒

D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达

答案：B

考点二1.基因工程的概念基因工程的基本操作程序

[考点梳理]基因重组(1)供体：提供__________。(2)操作环境：______。(3)操作水平：________水平。(4)原理：___________。(5)受体：表达目的基因。受体(6)本质：性状在______体内的表达。目的基因体外分子

(7)优点：克服_________________的障碍，定向改造生物的遗传性状。

(8)基本操作程序。远缘杂交不亲和

2.目的基因的获取

(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。

(2)获取方法。 说明：基因文库相当于某种生物的基因仓库，储存着大量该物种的基因。②人工合成3.基因表达载体的构建——重组质粒的构建(1)构建基因表达载体的目的。①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。②使目的基因能够表达和发挥作用。(2)构建步骤。(3)基因表达载体的组成。4.将目的基因导入受体细胞的方法农杆菌转化显微注射感受态细胞5.目的基因的检测与鉴定

[易错诊断]1.为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。()答案：×2.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。()答案：√3.检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。(

)答案：√

[基础测评] 1.某蔬菜地栽种了一种抗虫大白菜，是运用转基因技术把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因DXT转移到大白菜细胞中培育而成的，在这一过程中要进行基因表达载体的构建。根据所学知识推断，作为重组载体应具备的结构有()A.目的基因、启动子B.目的基因、终止子C.目的基因、启动子、终止子D.目的基因、启动子、终止子、标记基因答案：D2.下图为基因表达载体的模式图，若结构a是基因表达载)体所必需的，则a最可能是( A.氨苄青霉素抗性基因

B.启动子

C.限制酶

D.DNA连接酶

答案：B3.从浩瀚的“基因海洋”中获得特定目的基因的方法有()②PCR扩增技术扩增①从基因文库中获取目的基因③人工合成基因④RNA复制B.①②③④D.①②③A.①②④C.②③④答案：D考点三基因工程的应用、生物技术的安全性及蛋白质工程

[考点梳理]1.基因工程的应用(1)基因工程的应用举例。(2)基因工程药物。①来源：主要来自转基因的工程菌，也可来自各类生物反应器。②成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。③作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。(3)比较基因治疗与基因诊断。正常基因碱基互补DNA探针配对2.生物技术的安全性和伦理问题(1)转基因生物的优缺点。(2)试管婴儿与克隆人。①试管婴儿和设计试管婴儿的比较。

a.不同点：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断或基因诊断，试管婴儿不需进行遗传学诊断或基因诊断。图中①②③是试管婴儿的培育过程，①②④⑤是设计试管婴儿的培育过程。

应用：试管婴儿主要是解决不孕不育夫妇的生育问题，设计试管婴儿主要用于白血病、贫血症等疾病的治疗。

b.相同点：都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都属于有性生殖。 ②治疗性克隆和生殖性克隆的比较。(3)生物武器的特点及传播途径。①特点：传染性强；污染面广，危害时间长；难以防治；具有一定的潜伏期；受自然条件影响大。②传播途径：经食物和水传播；空气传播；接触传播；虫媒传播；病原体直接传播。3.蛋白质工程结构规律生物功能(1)概念。①基础：蛋白质分子的_________及其与_________的关系。②手段：通过_________或_________，对现有蛋白质进行_________。基因修饰基因合成基因改造(2)蛋白质工程流程图。(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出____________。(4)应用：主要集中应用于对____________进行改造，改良生物性状。新的蛋白质现有蛋白质(5)基因工程和蛋白质工程的比较。(续表)(续表)

[易错诊断]1.蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操)作，定向改变分子的结构。(

答案：×2.基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质。()答案：√3.动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质，不)一定是为了产生体型巨大的个体。(

答案：√4.由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。()

答案：×

5.利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物)的乳腺细胞中。(

答案：×[基础测评]1.蛋白质工程的基本途径是()①预期蛋白质功能②推测应有的氨基酸序列③表达(转录和翻译)④形成预期功能的蛋白质⑤合成相对应的脱⑥设计预期的蛋白质结构

B.⑤③②⑥④① D.⑥①②⑤③④氧核苷酸序列(基因) A.①②③⑤⑥④ C.①⑥②⑤③④

答案：C2.科学家已能运用基因工程技术，让羊的乳腺合成并分泌人体某些种类的抗体，以下叙述不正确的是()A.该技术可导致定向变异B.表达载体中需要加入乳腺蛋白的特异性启动子C.目的基因是抗原合成基因D.受精卵是理想的受体细胞答案：C3.基因工程与蛋白质工程的区别是()

A.基因工程需对基因进行分子水平操作，蛋白质工程不需对基因进行操作

B.基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程可以合成自然界不存在的蛋白质

C.基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平(或性状水平)操作

D.基因工程与蛋白质工程完全不同

答案：B考向1限制性核酸内切酶

[典例1](2019年新课标Ⅰ卷)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。

(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________和____________。

(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是____________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的____________。

(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________________________________。

[解析](1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是解旋酶。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至90～95℃。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。[答案](1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至90～95℃氢键

(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活与DNA技术有关的酶的比较(续表)(续表)(1)DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。

(2)限制性核酸内切酶的作用是识别、切割某种特定的脱氧核苷酸序列，使两条链在特定的位置断开，而解旋酶是将连接DNA的两条链的氢键打开形成单链。(3)基因工程中目的基因的获取和质粒的切割都由相同的限制性核酸内切酶切割。

(4)DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶分别以DNA单链或RNA单链为模板，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶不需要模板。(5)上述酶的化学本质都是蛋白质。

[考向预测] 1.(2019年江苏徐州模拟)已知限制性内切酶Xma

Ⅰ和SmaⅠ的识别序列分别为—C↓CCGGG—和—CCC↓GGG—。有关这两种酶及应用的叙述，错误的是()A.这两种酶作用的底物都是双链DNAB.DNA中出现这两种酶识别序列的概率不同C.XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是—GGCCD.使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等

解析：限制酶作用的底物是双链DNA

分子，A正确；这两种限制酶识别的序列相同，故DNA中这两种酶识别序列出现的概率相同，B错误；根据碱基互补配对原则，CCCGGG的互补链是GGGCCC，并根据XmaⅠ的切割位点可知，切割后的黏性末端是—GGCC，C正确；温度能影响酶的活性，所以使用酶时需要注意控制反应温度和时间等，D正确。答案：B

2.将某病毒的外壳蛋白(L1)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因连接，构建L1—GFP融合基因，再将融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。图中限制酶E1至E4处理产生的黏性末端均不相同。下列叙述不正确的是()

A.构建L1—GFP融合基因需要用到E1、E2、E4三种酶 、E4双酶切确保L1—GFP融合基因与载体的正确连接

C.GFP可用于检测受体细胞中目的基因是否表达

D.将表达载体转入乳腺细胞，可培育乳汁中含L1蛋白的转基因羊

解析：构建L1—GFP融合基因需要先用内切酶处理获得L1基因和GFP基因，并将二者连接，故需要用到E1、E2、E4三种酶，A正确；图中限制酶E1至E4处理产生的黏性末端均不相同，E1、E4双酶切可以有效减少载体自身连接和融合基因自身连接，保证L1—GFP融合基因与载体准确连接，B正确；绿色荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达，C正确；为了获得L1蛋白，可将表达载体转入受精卵中而不是乳腺细胞，用于培育乳汁中含有L1蛋白的转基因羊，D错误。答案：D考向2基因工程的原理及工具

[典例2](2018年海南卷)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：

(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜________(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是______________________________________。

(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中______________已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到____________(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。

(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用________作为外植体进行组织培养。

(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为______________________________________________________________。

[解析](1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，理由是叶片伤口处的细胞会释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用茎尖作为外植体进行组织培养。(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。[答案](1)受伤的叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞(2)甜蛋白基因核基因组

(3)茎尖

(4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型[考向预测]

3.(2019年天津滨海七校高三联考)基因工程中，GUS基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物，GFP基因会产生绿色荧光蛋白，这两种基因都可作为标记基因来研究发育生物学的问题。利用双CRISPR/Cas9系统和Cre/loxP重组酶系统技术可更好地实现该研究。请据图作答：图1图2

(1)图1为双CRISPR/Cas9系统作用示意图。该系统能够特异性识别DNA序列并切割特定位点，图中行使这些功能的分子结构分别是____________、____________。图中向导RNA与DNA结合的原理是____________。将删除区切割后，转入基因与原DNA片段可通过形成____________拼接起来，形成新的DNA序列。

(2)双CRISPR/Cas9系统可直接在靶细胞内起作用，与传统的基因工程相比，该操作无需__________(填写工具)。与质粒载体导入外源基因比，双CRISPR/Cas9系统编辑的基因可以不含____________________________________________。

(3)图2为Cre/loxP重组酶系统作用示意图。利用双CRISPR/Cas9系统可精准地将loxP序列、GUS基因及GFP基因连接，接上35s启动子之后可在组织中检测出蓝色而无绿色荧光区，这是由于__________基因自身无启动子而无法表达。Cre基因是重组酶基因，经38℃热处理后可被激活表达，在此前提下组织中可检测出绿色荧光区，据此分析绿色荧光区形成的原因是_____________________________________________________，采用__________________等手段可以扩大组织中绿色荧光区的面积。

解析：(1)图1为双CRISPR/Cas9系统作用示意图。该系统能够特异性识别DNA序列并切割特定位点的原因分别是向导RNA能识别特定序列、Cas9蛋白能定点切割DNA序列。图中向导RNA与DNA结合的原理是碱基互补配对。将删除区切割后，转入基因与原DNA片段可通过形成磷酸二酯键拼接起来，形成新的DNA序列。(2)双CRISPR/Cas9系统可直接在靶细胞内起作用，与传统的基因工程相比，该操作无需载体(运载体)。与质粒载体导入外源基因相比，双CRISPR/Cas9系统编辑的基因可以不含启动子、终止子和标记基因。(3)GUS基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物，GFP基因会产生绿色荧光蛋白，在组织中检测出蓝色而无绿色荧光区，说明GUS基因正常表达而GFP基因不能正常表达，根据“Cre基因是重组酶基因，经38℃热处理后可被激活表达，在此前提下组织中可检测出绿色荧光区”提示，可见GFP基因的正常表达需以Cre基因被激活表达为前提，即GFP基因自身无启动子，无法启动自身的表达。通过用Cre重组酶处理后，切割loxP序列，产生GFP基因的启动子，使GFP基因得以表达。由于Cre基因是重组酶基因，经38℃热处理后可被激活表达，因此热处理时间越长，越有利于基因的表达，绿色荧光区的面积就越大。答案：(1)向导RNACas9蛋白碱基互补配对磷酸二酯键(2)载体(运载体、质粒)启动子、终止子和标记基因(3)GFP重组酶能(特异性识别并)切割loxP序列，使GFP基因得以表达延长热处理时间考向3基因工程的基本操作程序

[典例3](2018年新课标Ⅰ卷)回答下列问题：

(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了___________________________________________________________(答出两点即可)。

入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与_______组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是______________________。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的___________方法导

(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加__________的抑制剂。

[解析](1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋处理，目的是以增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞。噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。

[答案](1)体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶[考向预测]

4.(2019年江苏卷)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：图1图2(1)EcoRV酶切位点为…GAT↓ATC……CTA↑TAG…，EcoRV酶切出来的线性载体P1为______末端。

(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。

(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________、________。

(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是___________________________。解析：(1)根据题意分析，EcoRV

酶识别的序列是－GATATC－，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。(2)据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要加一个碱基T

形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。(3)根据以上分析可知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。(4)据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物(甲、乙)从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。答案：(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA连接(3)BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒(4)乙、丙目的基因反向连接考向4基因工程的应用

[典例4](2018年新课标Ⅱ卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达，某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：

(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是____________，使用这两种酶进行酶切是为了保证____________，也是为了保证________________。

(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了__________和____________过程。

(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的__________移入牛的________中，体外培养，胚胎移植等。

(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的__________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。

[解析](1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切既保证了甲的完整，也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是E1和E4。(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。[答案]

(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核

去核卵母细胞(4)核DNA基因工程操作过程中的四个注意点

(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。

(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。

(3)目的基因的插入点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。

(4)基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象：第一步存在于用逆转录法等获得DNA

时，第二步存在于黏性末端连接时，第四步存在于分子水平杂交检测时。

[考向预测] 5.B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。下列关于该实验的叙述，错误的是()

注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。A.B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录B.可利用水稻体细胞和精子中的RNA构建cDNA文库，从中获得B基因中编码蛋白的序列C.过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测T-DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上D.在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光

解析：启动子是与RNA

聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A正确；目的基因获取途径之一就是从cDNA文库中获得，B正确；检测T-DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应该用DNA分子杂交法，C错误；由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D正确。答案：C

6.(2019年四川成都模拟)图1所示为用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段的示意图；图2所示为三种质粒结构，含复制原点标记基因(图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因)、EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶切割位点等。请回答下列相关问题：图1图2(1)组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是____________。

(2)图2中质粒A、质粒C能否作为目的基因运载体最理想的质粒？________(填“能”或“否”)，请说明理由______________________________________________________________。(3)重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为10－7，用质－粒B构建重组质粒后，为了筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌，在导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是_________________________________________________，最可能是_____________________________________________。

(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需要将重组质粒导入至山羊的________(细胞种类)中。

解析：(1)脱氧核糖和磷酸交替连接构成DNA片段D的基本骨架，脱氧核糖由C、H、O三种元素组成，组成磷酸的元素是H、P、O；磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架，磷脂分子是由C、H、O、N、P组成，可见组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是C、H、O、P。(2)分析图2可知：质粒A缺少标记基因，质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，进而影响重组质粒的自主复制，所以质粒A、质粒C均不能作为目的基因运载体最理想的质粒。(3)用质粒B构建重组质粒，当用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割时，Tc遭到破坏，而Ap结构完好，因此在重组质粒导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是在含四环素的培养基上能正常生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长。因重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为10－7，所以最可能是在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需要将重组质粒导入山羊的受精卵中。

答案：(1)C、H、O、P(2)否质粒A缺少标记基因，质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，会影响重组质粒的自主复制(3)在含四环素的培养基上能正常生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长(4)受精卵考向5生物技术的安全性和伦理问题

[典例5](2018年河南信阳模拟)生物技术是一把双刃剑，既可以造福人类，也可能因使用不当给人类带来灾难。请回答下列有关生物技术的安全性和伦理性问题：

(1)由于科学发展水平的限制，在转基因生物中，有时候会出现一些人们意想不到的后果，引发了人们在食物安全、生物安全和__________安全三个方面发生了激烈的争论。

(2)在转基因生物或产品研究过程中，绝大多数科学家都能自觉遵守科学研究道德。如对外源DNA进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的________。

(3)为解决不孕不育夫妇的生育问题而出现了试管婴儿技术，而2002年，英国一对夫妇通过设计试管婴儿，利用新生儿脐带血中造血干细胞，挽救患地中海贫血症的男孩。这两项技术的区别是____________________不需要经过基因检测。

[解析](1)转基因生物的安全性在以下三个问题方面存在争议：食物安全(滞后效应、过敏源、营养成分改变)、生物安全(对生物多样性的影响)、环境安全(对生态系统稳定性的影响)；(2)在转基因生物或产品研究过程中，需对外源DNA进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的蛋白质；(3)设计试管婴儿技术是通过体外受精获得许多胚胎，然后从中选择符合要求的胚胎，再经移植后产生后代的技术。[答案](1)环境(2)蛋白质(3)试管婴儿技术[考向预测]7.生物技术的迅猛发展挑战了原有的社会伦理道德秩序，引起了激烈的争论。

(1)支持者认为，克隆人是一项科学研究，应当有它内在的发展规律，允许有一定的发展。反对者则认为，克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念，克隆人是在人为地制造________________________________________都不健全的人。

(2)在针对克隆技术的争论中，我国政府态度明确，及时立法，规范了克隆技术的应用。我国明确禁止生殖性克隆人，一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、________任何生殖性克隆人的实验。

(3)设计试管婴儿与试管婴儿在技术手段上的区别是___________________________________________，前者的生殖方式是____________。答案：(1)心理上和社会地位上(2)不接受(3)多了胚胎移植前进行遗传诊断这一环节有性生殖考向6蛋白质工程

[典例6](2018年天津卷)甲型流感病毒为RNA

病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。

(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。

(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。

(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加______________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。A.病毒的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶

B.宿主的DNA聚合酶D.宿主的RNA聚合酶

(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起_______免疫，增强免疫保护效果。

[解析](1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(