除氧剂及益生元对双歧杆菌微胶囊化的影响

除氧剂及益生元对双歧杆菌微胶囊化的影响

双盲菌是肠球菌中非常重要的一种。它对人体具有重要的生理和健康功能，如抗癌、抑制腐生菌生长、减少胆固醇、合成维生素和促进钙吸收。有研究者［４］提出肠道中双歧杆菌的多少可以在一定程度上反应出一个人的健康状况。目前,国内外对双歧杆菌有关的保健食品开发很多,包括口服液、粉剂、片剂、胶囊等,但是因为双歧杆菌在生长过程中,抗性及耐酸性较差,对氧气极为敏感,并且在活性的保持上比较困难［５－８］,所以目前市场上所销售的液态或粉态双歧杆菌产品中的活菌数会呈指数下降趋势,保健功效损失快［９，１０］。微胶囊技术可以在一定程度上解决双歧杆菌制品在销售和消费过程中的活菌保持问题。国内外关于双歧杆菌微胶囊化的研究很多,丸山哲彦等［１１］利用锐孔-凝固浴法将双歧杆菌微胶囊化,发现细菌存活率在50%以上。史怀平等［１２］通过试验得到了活菌数达到5.8×10１１g－１的双歧杆菌微胶囊。本课题组在前期的研究［１３］中利用乳化法对双歧杆菌BB01和BB03的微胶囊化条件进行了研究。双歧杆菌专性厌氧,除氧剂的使用可消除氧对双歧杆菌的破坏,益生元作为双歧杆菌的生长促进因子,可在一定程度上促进双歧杆菌的生长［１４，１５］。本试验拟在之前研究的基础上考察除氧剂及益生元对双歧杆菌微胶囊化的影响,为进一步优化双歧杆菌微胶囊化过程,获得活菌数及包埋率较高的双歧杆菌微胶囊提供参考。1材料和方法1.1材料和设备1.1.1培养基的制备两歧双歧杆菌BB01和BB28:由陕西科技大学生命科学与工程学院1-C419实验室提供;改良MRS培养基:青岛海博生物科技有限公司;海藻酸钠、壳聚糖:分析纯,西安罗森伯科技有限公司;低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、菊糖、碳酸氢钠、胃蛋白酶及胰蛋白酶:分析纯,西安罗森博生物科技有限公司;抗坏血酸、异抗坏血酸、抗坏血酸钠:分析纯,美国Sig-ma公司。1.1.2仪器、设备和药剂电热恒温培养箱:DH5000AB型,中国天津泰斯特仪器有限公司;电热鼓风干燥箱:WG-71型,中国天津泰斯特仪器有限公司;手提式蒸汽压力灭菌器:SYQ-DSX-280A型,上海帅佳电子科技有限公司;磁力搅拌器:FW-200型,北京中兴伟业仪器有限公司;回转式恒温调速摇瓶柜:HYG型,上海欣蕊自动化设备有限公司。1.2微胶囊化的制备1.2.1菌种的活化将两歧双歧杆菌BB01和BB28的冻干菌粉分别接种于经118℃灭菌15min的MRS肉汤培养基中,在温度为37℃的条件下恒温培养24h。将两种双歧杆菌活化3次(最后一次活化18h)后备用。1.2.2微胶囊制备将已活化的第三代菌种BB01和BB28分别按5%的接种量接在发酵培养基中,并在37℃下培养18h,离心(10000r/min,20min)后收集菌泥,再利用0.9%的生理盐水将双歧杆菌的菌悬液稀释至10－８后,将两种菌的菌悬液和海藻酸钠［１６］溶液分别按1∶10(V∶V)的比例混合,之后分别加入到植物油中(含0.4%的吐温80),乳化15min后分别用无菌压力喷嘴将乳化液喷入置于磁力搅拌器上的CaCl２溶液中,静置15min后,用纱布过滤,最后用生理盐水冲洗3次得微胶囊。其中海藻酸钠、CaCl２浓度均为2%,菌悬液与海藻酸钠的混合液和植物油的体积比为1∶5。1.2.3不同除氧剂和益生元对双歧杆菌微胶囊化的影响在按照1.1.2所示的方法制备微胶囊的过程中,分别将5种不同的除氧剂(半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸、抗坏血酸钠、异抗坏血酸和异抗坏血酸钠),每种以0.05%的量加入至菌悬液与海藻酸钠混合液中;5种不同益生元(菊糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖和低聚果糖),每种以5%的量加入至菌悬液与海藻酸钠混合液中,制备微胶囊。以包埋活菌数和包埋率为考察指标,筛选出对双歧杆菌BB01和BB28微胶囊化影响效果最好的两种除氧剂和益生元,并将筛选出的除氧剂和益生元分别进行进一步试验,以此来观察其对双歧杆菌微胶囊化效果的影响。1.2.4活菌计数活菌计数即将待测试的样品采用0.9%的无菌生理盐水溶解配制成为菌悬液,随后将其以10倍梯度进行稀释,最后分别取稀释度为10－７到10－８的菌悬液0.1mL接种在高层琼脂培养基中进行培养,在同一稀释倍数下进行3次重复试验,在温度为37℃条件下培养48h之后,进行观察计数并取其平均值,最终换算为单位体积的活菌数。按式(1)进行活菌数的计算:式中:N———每毫升原菌液所含活菌数,CFU/mL;N０———同一稀释度3个重复培养基菌落的平均数,CFU/mL;T———所稀释倍数。1.2.5包埋产率的计算取双歧杆菌微胶囊1g置于9mL的缓冲液(pH=4.0)和肠溶液(pH=6.8)中,于(37±1)℃恒温振荡,处理40min,活菌计数分别为B１、B２,再取1g微胶囊化前的菌胶混合液进行活菌数记为B３,按式(2)进行包埋产率的计算:式中:Y———包埋产率,%;B１———用缓冲液处理后的微胶囊中的活菌数,CFU/mL;B２———用肠溶液处理后的微胶囊中的活菌数,CFU/mL;B３———原菌液中的活菌数,CFU/mL。2结果与分析2.1微胶囊包埋活菌数和包埋产率结果根据1.2.2和1.2.3所述方法制备双歧杆菌微胶囊,不同除氧剂及益生元对双歧杆菌BB01和BB28微胶囊活菌数及包埋率的影响见图1~4。由图1~4可知:在相同的浓度条件下,对双歧杆菌BB01而言,5种类型除氧剂中的半胱氨酸盐酸盐和异抗坏血酸钠,以及5种类型益生元中的菊糖和低聚果糖对其微胶囊包埋活菌数及包埋产率的影响效果最佳;对双歧杆菌BB28而言,除氧剂抗坏血酸钠和异抗坏血酸,益生元低聚木糖和低聚果糖对其微胶囊包埋活菌数及包埋产率的影响效果最佳。由图1还可以看出,除氧剂异抗坏血酸对双歧杆菌BB28微胶囊的有利影响较为显著,明显要比其他除氧剂的影响效果好。2.2微胶囊的活菌数及包埋率根据2.1所示的结果,将除氧剂半胱氨酸盐酸盐和异抗坏血酸钠按1.2.2和1.2.3所述的方法制备微胶囊,其对双歧杆菌BB01微胶囊活菌数及包埋产率的影响见图5、6。由图5和6可知,伴随着半胱氨酸盐酸盐添加量的递增,双歧杆菌BB01微胶囊的包埋活菌数及包埋产率均呈先增大后减小的趋势,图形走向有很好的对应性:当半胱氨酸盐酸盐的加入量增加到0.05%时,双歧杆菌BB01微胶囊活菌数由1.65×10９CFU/mL增加到2.2×10９CFU/mL,包埋率由36%增加到54%;但是伴随着半胱氨酸盐酸盐的继续加入,微胶囊活菌数及包埋率都会降低。随着异抗坏血酸钠加入量的递增,双歧杆菌BB01微胶囊的包埋活菌数及包埋产率呈增大的趋势,其中活菌数由1.6×10９CFU/mL增加到2.9×10９CFU/mL,包埋率由45%增加到82%。这是由于异抗坏血酸钠加入量过小所造成的,当除氧剂的添加量较低时,整个体系中还有氧气的残留,从而造成了容易受氧气影响的双歧杆菌的死亡,因此其微胶囊所含的活菌数和包埋产率水平不高,但随着除氧剂添加量的递增,整个体系中无氧气的残留,包埋的效果明显变好。但是再继续添加除氧剂到一定量时,可能在此过程中改变了海藻酸钠浓度的原因,微胶囊的包埋活菌数及包埋产率又会呈下降的趋势。根据图5和6可初步得出,在微囊化双歧杆菌BB01时,半胱氨酸盐酸盐的量应为0.05%,其相应的包埋活菌数及包埋产率分别为2.2×10９CFU/mL,54%;异抗坏血酸钠的量应为0.09%,其相应的包埋活菌数及包埋产率分别为2.9×10９CFU/mL,82%。通过多种因素对双歧杆菌生长影响的研究［１７］,发现半胱氨酸盐酸盐对双歧杆菌的影响极为重要。另外,异抗坏血酸钠的加入会极大的降低氧气对双歧杆菌的影响,使得双歧杆菌活菌数与对照组相比是明显增加的,这一现象在文献中也曾出现。2.3微胶囊包埋活菌数和包埋产率根据2.1所示的结果,将益生元菊糖和低聚果糖按1.2.2和1.2.3所述的方法制备微胶囊,其对双歧杆菌BB01微胶囊的包埋活菌数及包埋产率的影响见图7、8。由图7和8可知,随着菊糖及低聚果糖加入量的递增,双歧杆菌BB01微胶囊的包埋活菌数和包埋产率都是呈先增大后减小的趋势:当菊糖加入量增加到3%时,双歧杆菌BB01微胶囊活菌数由3.0×10９CFU/mL增加到最大(4.6×10９CFU/mL),包埋产率由52%增加到最大(80%),之后便呈下降趋势;当低聚果糖加入量增加到5%时,双歧杆菌BB01的微胶囊活菌数由0.92×10９CFU/mL增加到最大(1.7×10９CFU/mL),包埋率由10%增加到最大(80%),之后呈下降趋势。这可能是由于刚开始时益生元的加入量较低,其对双歧杆菌的促进生长的效果并不是很明显,所以微胶囊的包埋活菌数和包埋产率并不高,但是随着益生元添加量的逐步增多,益生元便显著性地发挥了其促进双歧杆菌生长的效果,使得微胶囊的包埋效果明显变好。但是再继续添加益生元到一定量时,可能是由于在此过程中改变了海藻酸钠的浓度,微胶囊的包埋活菌数和包埋产率又会呈下降的趋势。由图7和8可初步得出,在微囊化双歧杆菌BB01时,菊糖量应为3%,其相应的包埋活菌数及包埋产率分别为4.6×10９CFU/mL,80%,低聚果糖量应为5%,其相应的包埋活菌数及包埋产率分别为1.7×10９CFU/mL,80%。人体每天摄入一定量的菊糖或低聚果糖,肠道菌群中双歧杆菌和乳酸菌的数量会明显增加,但对健康无不良影响［１８］,所以菊糖及低聚果糖对双歧杆菌有一定的促进生长作用。2.4抗坏血酸钠添加量对微胶囊包埋效果的影响根据2.1所示的结果,将除氧剂抗坏血酸钠和异抗坏血酸钠按照1.2.2和1.2.3所述的方法制备微胶囊,其对双歧杆菌BB28微胶囊的包埋活菌数及包埋产率的影响结果见图9、10。由图9和10可知,随着抗坏血酸钠及异抗坏血酸钠量的递增,双歧杆菌BB28微胶囊的包埋活菌数和包埋产率均呈先增大后减小。当异抗坏血酸钠的量增加到0.03%时,双歧杆菌BB28微胶囊活菌数由1.4×10９CFU/mL增加到最大(1.7×10９CFU/mL),包埋产率由57%增加到最大(66%),之后便呈下降趋势;当抗坏血酸钠加入量增加到0.05%时,双歧杆菌BB28的微胶囊活菌数由2.82×10９CFU/mL增加到最大(3.9×10９CFU/mL),包埋率由60%增加到最大(77%),之后呈下降趋势。这可能是由于当除氧剂的添加量较低时,整个体系中还有氧气的残留,从而造成了双歧杆菌的死亡,因此微胶囊的包埋活菌数和包埋产率并不高,但随着除氧剂添加量的增多,整个体系中便会无氧气的残留,这就使得微胶囊的包埋效果明显变好。但是再继续添加除氧剂到一定量时,双歧杆菌BB28微胶囊的包埋活菌数及包埋产率又会呈下降的趋势,这可能是因为改变了体系中海藻酸钠浓度的原因。由图9和10可初步得出,在微囊化双歧杆菌BB28时,抗坏血酸钠的量应为0.05%,其相应的包埋活菌数及包埋产率分别为3.9×10９CFU/mL,77%;异抗坏血酸钠量应为0.03%,其相应的包埋活菌数及包埋产率分别为1.7×10９CFU/mL,66%。根据文献可知,向双歧杆菌培养液中加入3.2g/L的异抗坏血酸钠,或者添加1.6g/L的抗坏血酸盐,其活菌数都会比对照组增加1~2倍,消除了氧对双歧杆菌的胁迫性影响。2.5低聚不同益生元添加量对微胶囊包埋活菌数和包埋产率的影响根据2.1所示的结果,将益生元低聚果糖和低聚木糖按1.2.2和1.2.3所述的方法制备微胶囊,其对双歧杆菌BB28微胶囊的包埋活菌数及包埋产率的影响见图11、12。由图11和12可知,随着低聚木糖及低聚果糖量的递增,双歧杆菌BB28微胶囊的包埋活菌数和包埋产率均呈先增大后减小的趋势:当低聚果糖加入量增加到7%时,双歧杆菌BB28微胶囊活菌数由3.7×10９CFU/mL增加到最大(4.9×10９CFU/mL),包埋产率由47%增加到最大(60%),之后便呈下降趋势;当低聚果糖加入量增加到7%时,双歧杆菌BB28的微胶囊活菌数由1.8×10９CFU/mL增加到最大(4.3×10９CFU/mL),包埋率由66%增加到最大(80%)。这可能是由于当益生元的加入量较低时,其促进双歧杆菌生长的效果不是很明显,因此造成双歧杆菌BB28微胶囊的包埋活菌数和包埋产率并不高,但是随着益生元添加量的增多,益生元便会显著性地发挥其对双歧杆菌的促生长作用,这就使得双歧杆菌微胶囊的包埋效果明显变好。但是再继续添加益生元到一定量时,双歧杆菌BB28微胶囊的包埋活菌数和包埋产率又会呈下降的趋势,这可能是由于改变了整个体系中海藻酸钠的浓度。由图11和12初步可得出,在微囊化双歧杆菌BB28时,低聚果糖的添加量应为7%,其相应的包埋活菌数及包埋产率分别为4.9×10９CFU/mL,60%;低聚木糖添加量应为7%,其相应的包埋活菌数及包埋产率分别为4.3×10９CFU/mL,80%。根据文献可知,在厌氧的环境下加入低聚果糖,可以促进双歧杆菌的生长,其活菌数由1.5亿/mL增加