浅谈志贺氏菌检测技术的研究进展

浅谈志贺氏菌检测技术的研究进展

根据中国的总体土壤信息，志贺菌是中国感染腹泻的第一种菌。志贺氏菌既可通过水,也可通过食品传播腹泻及痢疾等疾病。据报道,国际上每年都有由志贺氏菌引起的疾病的暴发与流行。根据WHO年度报告,亚(不包括中国)、非、拉各洲仅小于5岁的儿童每人每年发生腹泻2.2次,细菌性腹泻的病例多达1.5~2.5亿人。我国广大农村地区由于卫生条件差,经常有由于水源或食品受到志贺氏菌污染而引起痢疾、腹泻等疾病流行的报道。因此,快速检测与鉴定水或食品中志贺氏菌,不仅为及时有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病提供依据,同时也是保障人民身体健康的必要手段。1志贺氏菌的介绍1.1志贺氏菌的生长特性志贺氏菌属(Shigella)的细菌(通称痢疾杆菌),是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多,有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等,还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾,其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢,死亡率甚高。志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别,为革兰氏阴性杆菌,长约2~3μm,宽0.5~0.7μm。不形成芽胞,无荚膜,无鞭毛,有菌毛。DNA的G+C为49~53g分子%(Tm法)。需氧或兼性厌氧;营养要求不高,能在普通培养基上生长,最适温度为37℃,最适pH为6.4~7.8。37℃培养18~24h后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐,直径约2nm,宋内氏菌菌落一般较大,较不透明,并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长,无菌膜形成。福氏志贺氏菌菌落中等大小,圆形灰色,稍凸起,不溶血。本菌属都能分解葡萄糖产酸不产气,大多不分解乳糖,无动力。仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。氧化酶、蔗糖、肌醇、卫矛醇、鼠李糖、本胶糖、脲酶、V—P试验、枸橼酸盐、苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸、明胶均为阴性;硝酸盐还原,甲基红、甘露醇、靛基质均为阳性。1.2志贺氏疾菌u型志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同,可分为二大组。A、不分解甘露醇组:主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质,进一步分靛基质阳性(1、3、4、5、6、9、10型)和靛基质阴性(2、7、8型)的志贺氏痢疾菌。B、分解甘露醇组:包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况,分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否,分靛基质阳性(福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型)和靛基质阴性(福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14)二类,(见图1)。1.3菌株组成及结构志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原(O)及表面抗原(K)组成。主要抗原有三种。型特异性抗原:型多糖抗原为菌体抗原的一种,是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时,此抗原也常随之消失,各菌型所含的型抗原不同,可用于区别菌种的型别。群特异性抗原:为光滑型菌株的次要抗原,也是菌体抗原的一种。特异性较低,常在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中,由于所含群抗原不同,可将某些菌型分为多种亚型,如福氏菌2型,根据群抗原不同,可分成2a、2b两个亚型。表面抗原(K抗原):在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热,加热100℃/1h即被破坏。具有此种抗原的菌株,可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。根据抗原构造的不同,按最新国际分类法,将本属细菌分为四个群、39个血清型(包括亚型)(见表1)。A群:也称志贺氏菌群,有10个血清型。不发酵甘露醇,无鸟氨酸脱羧酶,与其他各群细菌无血清学联系。B群:也称福氏菌群,已有13个血清型(包括亚型和变种)。最近又发现3个亚型(1c、4c、5b)。发酵甘露醇,无鸟氨酸脱羧酶。抗原结构较复杂,各型间有交叉凝集。每一福氏菌型具有二种抗原,即型特异性抗原和群抗原,前者只存在于同型菌株中,后者有许多种,存在于福氏各菌型中。例如福氏1b型除含有1型特异性抗原外,尚含有4、6群抗原。C群:也称鲍氏菌群,有15个血清型,分解甘露醇,无鸟氨酸脱羧酶。各型内无交叉凝集。D群:也称宋内氏菌群,仅有一个血清型。分解甘露醇,有鸟氨酸脱羧酶,迟缓发酵乳糖。有Ⅰ、Ⅱ相之分。2志贺氏菌对常用抗菌素的耐药性志贺氏菌属在外界环境中的生存力,以宋内氏最强,福氏菌次之,志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34d,37℃水中存活20d,在冰块中可存活96d,在粪便内(室温)存活11d。日光直接照射30min,56~60℃10min即被杀死,对高温和化学消毒剂很敏感,1%石炭酸中15~30min即被杀死,对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感,但易产生耐药性。自从广泛使用抗菌素以来,志贺氏菌的耐药菌株不断增加,给防治工作带来许多困难。国内部分地区报道(1972~1974),志贺氏菌对四环素的耐药率达74%、氯霉素73.6%~97%、链霉素84%~98%、合霉素75%~100%、磺胺类97%~100%,可见对国内常用几种抗菌素的耐药率相当高。无论是在革兰氏阳性菌还是在革兰氏阴性菌中,都广泛存在着染色体外的遗传物质——质粒。在病原微生物和环境微生物中,这些野生型质粒所携带的遗传物质对其生理过程是非常重要的,常常是区别于其它微生物的典型特征,因此质粒成为我们对微生物研究的重要内容。2000年徐平等人的研究表明,志贺氏菌的侵袭力是由质粒控制的,与其外膜蛋白VMA有关。随后,钟跃星研究志贺氏菌的耐药性时发现,当将菌株中的质粒消除之后,菌株的耐药谱显著减少,而质粒未消除者其耐药性没有明显变化。3生物化学的特性检测技术随着科学技术的发展,人类对生活的质量提出了越来越高的要求,所以食品安全问题(特别是致病菌)的快速检测方法被提到重点解决的地位,得到了科技界和政府的高度重视。生物化学中的快速专有酶反应和细菌代谢产物的检测技术;以免疫学方法建立的检测技术如酶免疫测定技术(ELA)和SPA法;分子生物学方面也发展出了核酸探针(nuclearacidprobe)、聚合酶链反应(polymerasechainreaction)和随机引物DNA扩增的多态性(RAPD)的检测技术。3.1次检测工艺生化鉴定是检测细菌最常用的方法,其检测的微量化和自动化,是微生物学诊断中的发展方向,不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异,利用微生物(主要是细菌)的不同生化和生理特性,可以对细菌进行鉴定。该方法特异性强,反应迅速,但一次检测完成样品项数较少,且检测步骤繁琐。另外,气相色谱和高效液相色谱也应用到致病微生物的检测中,依据不同病原体的化学组成或产生的代谢产物各异协助病原诊断和检测,其中以气相色谱应用较多。尽管该法简单、快速、可靠,但使用的仪器设备相对来说比较昂贵,所以不适合现场的快速检测。微生物专有酶快速反应也可进行细菌的快速检测。这种技术将传统的细菌分离和生化反应结合起来,使得检测结果直观。我国的王金良教授等应用此法检测沙门氏菌,反映只需5min,检测最低限可以达100cfu/ml。该法虽然快速,但不适合于含菌微量的样品检测。3.2核酸探针检测随着微生物学、生物化学和分子生物学的飞速发展,对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的形态结构和生理特性等一般检验上,而是从分子生物学水平上研究生物大分子,特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中,核酸探针、PCR、RAPD,以其敏感、快速、特异等特点成为生物技术革命的新产物,逐渐应用于食源性致病原菌的检测。核酸探针检测技术最大优点是特异性,且核酸之间的识别连接比抗原抗体准确、灵活。另外,核酸探针检测的最低限量可达到0.5pg。PCR技术往往与探针联合使用进行菌种鉴定。为提高探针的敏感性,可先将靶DNA序列扩增,增加DNA的数量,使其达到足够的检测量。目前,志贺氏菌检测方法存在着治理容易丢失和受内源菌干扰的问题,用核酸探针检测可以克服上述缺陷。1995年王军等人在检测粪便中志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌的实验中,使用PCR扩增技术,其敏感性可达≤1个细菌/g。但PCR扩增后需做凝胶电泳进一步鉴定,对常规检测来说太繁琐,且探针检测技术也存在一定问题,如检测一种菌就需要制备一种探针;要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养;有时会因样品中不含产毒素而无法检测。2003年李君文等人采用随机引物扩增DNA多态性(RAPD)技术对志贺氏菌进行再鉴定时发现,不同种的菌株,甚至同一种菌的不同型间的条带模式也存在一定差异,该技术也可用于志贺氏菌的鉴定。3.3elisa快速检测志贺氏菌的研究进展免疫学的发展,为快速检测致病菌提供了关键性的技术方法,使致病菌的快速检测得到了较大的发展和提高,从以前的经典免疫学技术如凝集实验、沉淀实验和补体实验发展到现在的酶免疫分析(EIA)、SPA法等。ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。国内于80年代初期引进酶联免疫实验原理并应用于临床。目前该技术在国内已经非常成熟。ELISA具有高度的特异性和敏感性,几乎所有可溶性的抗体抗原反应系统均可检测,最小可测值能够达到ng甚至pg水平。与放射免疫方法比较,ELISA的标记试剂较稳定,且无放射性危害;与免疫荧光相比,ELISA敏感性高,不需要特殊设备,结果观察简便。且方法稳定,结果可靠,在很多领域取代了荧光技术和放射免疫测定法。本实验室选用ELISA法建立了原料牛奶中志贺氏菌的检测技术,研究通过对原料奶中常见的志贺氏菌进行鉴定分析,确定其在原料奶中的优势菌株的分布,研制成功了快速检测试剂盒;研究同时建立了原料奶中志贺氏菌含量的预警系统,以期实现原料奶及乳制品的卫生安全的有效监控。SPA(StaphylococcalProteinA)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质成分,具有同人和多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力。SPA法是用含A蛋白丰富的金黄色葡萄球菌菌体与志贺氏菌属抗血清在一定条件下混合致敏,让抗体结合到金黄色葡萄球菌细胞壁A蛋白上,制成SPA诊断试剂。样品经过增菌后,即可用SPA诊断试剂来检验。由于金黄色葡萄球菌表面丰富的A蛋白能结合大量抗体,大大提高了检验方法的敏感性,缩短了检验周期。从而用于志贺氏菌的快速检测,以满足食品卫生监测和检验工作的需要。但因为乳制品安全检测项目中有金黄色葡萄球菌的检测,如果用SPA法,有可能会影响志贺氏菌的检测。4带进一步检测的细菌志贺氏菌属细菌