微乳体系中胰岛素稳定性的研究

微乳体系中胰岛素稳定性的研究

非注射给药系统的开发一直是药物学术界的难题和热点。除了体内的有效性外，药物在制剂中的化学和物理稳定性也是一个值得特别注意的任务之一。微乳作为药物载体易于制备和保存,具有保护不稳定药物,控释,增溶药物,提高药物生物利用度及易于给药等优点,受到越来越多的重视和应用。Xu等人研制的经口腔粘膜给药的胰岛素微乳体系,其相对生物利用度为29.2%。但是乳剂是一个多成分、多相共存的复合体系,任何乳制剂的开发研究中,其包裹的药物化学稳定性和用药安全性必须得到保证。本研究以RP-HPLC为分析手段,通过加速试验,研究了不同温度和振摇条件对微乳中胰岛素稳定性的影响,表明了微乳体系除了能促进胰岛素除透膜吸收外,还有较好的稳定作用。1实验部分1.1仪器、设备和仪器仪器:高效液相色谱仪:510型高压泵,486紫外检测器,WDL-95色谱工作站(大连化物所),稳定作用。色谱柱为HypersilODS2(250mm×4.6mm,id5μm大连依利特科学仪器有限公司);Hermlez323K台式高速冷冻离心机(德国);SB2200超声仪(上海必能信超声有限公司);HQL150-β大振幅恒温摇床(中科院武汉科学仪器厂);PXY-DHS-40×50恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂)。试剂:色谱级乙腈(美国Fisher公司):猪胰岛素(徐州生化厂,26.8IU/mg);TritonX-100(分析纯,Amresco公司);其余试剂均为国产分析纯,水为双蒸水。1.2实验方法1.2.1硫酸钠乙腈的检测色谱分析条件:流动相:0.1mol/L磷酸二氢钠:0.1mo1/L硫酸钠∶乙腈=36∶36∶28,用磷酸调节pH为3.0;流速1.0mL/min;紫外检测波长为214nm;进样量20μL,柱温为30°C。1.2.2胰岛素乳液的制备将胰岛素溶于含0.2%苯酚、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中配制3.0mg/mL胰岛素溶液。将大豆磷脂按1∶3的比例在超声的条件下溶于含0.5%冰片的丙二醇中。按1∶1将胰岛素溶液在搅拌条件下滴加到大豆磷脂的丙二醇溶液中并适当超声处理制得1.5mg/mL胰岛素乳液。取15.0mL置于恒温箱中,调节温度为25±1°C,每隔24h取样0.5mL置于4°C冰箱中冷藏保存。样品进行色谱分析前取0.2mL于10mL容量瓶中,用含0.15%TritonX-100的0.01mol/L的HCl溶液定容、摇匀,过滤进样分析。按上述同样步骤将胰岛素制剂贮存于37±1°C,49±1°C,60±1°C之中,取样、冷藏、处理、分析。1.2.3hcl-ms/l分离油/水相精确移取0.2mL1.2.2体中、37°C下各天的胰岛素微乳样品,加1.8mL0.01mol/L的HCl溶液振荡2min,2000r/min下离心5min,分离油、水相(pH上升为2.36)。水相中滴加0.1mol/LHCl调节pH值为2.0;对凝聚沉淀的油相,用0.15%TritonX-100的0.01mol/LHCl溶液10mL溶解,溶解后清亮透明,分别进样分析,测定其浓度。1.2.4样品处理及贮藏取1.2.2项胰岛素微乳储备液15.0mL置于恒温摇床中,调节温度为25±1°C,转速为60±1r/min每隔24h取样一次,冷藏并同1.2.2处理样品,进行分析。同样调节温度为25±1°C,转速为150r/min,重复上述实验。2结果与讨论2.1输注水受精处理后大鼠输注后胰岛素降解的回归方程胰岛素浓度c在5～200μg/mL范围内与吸光度A呈良好线性关系,回归方程为c=1.67322×10-4A+0.05702,r=0.9999。在取样时间范围内的各温度下微乳剂没有产生明显的絮凝,亦无沉降、分层、聚结等现象。以各微乳剂中所剩的胰岛素百分含量的对数(lnc/c0×100)对时间(t)进行线性回归,得各实验温度下回归方程,如表1所示。由表1可知各温度下,以一级动力学方程处理,线性关系较好,说明胰岛素在微乳体系中的降解过程符合一级反应动力学。由各温度下反应速率常数的对数lnk对1/T进行线性回归,得Arrhenius回归方程如表2。按此计算可得IBS在5°C时,k为4.60×10-4即ln(c/c0×100)=4.605-4.60×10-4t,一年和两年后制剂含量分别为84.5%与71.5%。将胰岛素微乳保存于5°C下一年和两年后,经分析其胰岛素为原标示量的81.3%和72.8%,二者基本相符。Oliverr曾对两种胰岛素的悬液进行了稳定性研究,证明了其降解以生成脱酰胺胰岛素为主,并符合一级反应动力学,所得活化能Ea为71.128kJ/mol;Dotsikas等对有、无甲基-β-环糊精(met-β-CD)的胰岛素中性溶液进行了动力学比较研究,在有met-β-CD条件下,胰岛素变性活化能Ea从92.048kJ/mol提高到96.232kJ/mol。而微乳中胰岛素降解活化能Ea=-R·斜率=98.22kJ/mol,比上述二者都大,说明微乳体系对胰岛素有较好的稳定作用。2.2油相控制胰岛素含量经测定胰岛素在微乳的油相和水相中的初始含量分别为88.44±6.7%和13.5±3.3%(n=6),将微乳及其油相与水相中胰岛素含量分别对时间作图,如图1所示。胰岛素在水相中降解快,8天后含量仅为初始量的58.7%,而此时在油相中,其含量为初始量的82.1%,降解过程明显减慢。由于分布于油相中的胰岛素含量大于游离于水相中胰岛素含量,使得整个微乳体系中胰岛素的降解过程受油相控制。对于以卵磷脂为乳化剂形成的乳剂,其pH值在6～7之间时最为稳定,本微乳pH值一般在6.5～7.5之间,水相中胰岛素在此条件下主要变性途径为降解生成B3脱酰胺胰岛素和聚结体。在油相中,经检测没有明显的脱酰胺胰岛素峰出现,说明油相可以阻止脱酰胺胰岛素的产生,另一方面,由于油相颗粒对胰岛素的吸附、镶嵌、包裹作用,及乳粒表面的双层负电荷的保护,必然阻止胰岛素聚集晶核的形成和扩展,减慢胰岛素聚结降解。正因为微乳中油相的良好稳定作用,提高包封率有助于提高稳定性,而将微乳制剂通过吸干或冻干制成干微乳值得进一步探究。2.3摆动速率对微乳胰岛素降解动力学的影响以各振摇动条件下各天乳剂中所剩的胰岛素百分含量的对数ln(c/c0×100)对时间t进行回归,结果如表3所示。在25℃条件下,r=0,60,150r/min摇速情况下,乳剂中未见沉淀,亦未见分层,无异映.外观颜色亦无变化。从表3可看出随摇动速率的增加,胰岛素在其微乳体系中依然按一级动力学方程降解。随着摇动速率的增加,胰岛素降解速率增大,但增大幅度不大。30天后对应于转速为0、60、150r/min的微乳中胰岛素的含量分别为75.8%、72.7%、71.1%。Nielsen等对振摇、胰岛素浓度、温度、pH值、溶液中的离子强度等环境因素对胰岛素降解动力学作了详细的研究,认为水溶液中胰岛素变性以生成聚集体为主,其中振摇是一个处于支配地位的因素。本研究的微乳体系中胰岛素变性主要发生在水相,但由于水相中