中国南部6个红树群落木榄叶片的总黄酮含量

中国南部6个红树群落木榄叶片的总黄酮含量

木橄榄是红木科的一种盐生植物，广泛分布于热带和亚热带沿海地区的冲积带。早期有关木榄的研究主要集中在对该植物的分类、分布、生理、生态以及对盐生环境的适应性研究方面,有关其药效活性成分的研究报道相对较少。长期以来的民间应用实践证明:木榄具有潜在的药用价值,主要表现在清热解毒、止泻、收敛、止血及截疟等方面,被广泛应用于治疗发烧、腹泻、止血、眼疾、咽喉肿痛以及对抗疟原虫等,但迄今很少见有关其药效活性成份的报道。黄酮类化合物是植物中广泛分布的一类次生代谢产物,在植物的生长发育和抗逆等过程中发挥着重要的作用;此外,来自植物的黄酮类化合物往往还具有抗氧化、抗菌、消炎、抗肿瘤以及抗病毒等药理活性,已经成为新药研究中重要的先导化合物来源。近年来,有关植物体内黄酮类化合物的研究报道呈现出明显上升的趋势。大量研究显示,在高盐、强紫外辐射、水淹、低温、高温以及干旱等条件下,植物体内的黄酮类化合物有蓄积的趋势,这种蓄积与其抗逆过程相关。鉴于木榄主要分布在高盐和强紫外辐射的赤道附近潮间带,我们推测木榄体内的黄酮类化合物含量较高,并具有多样性的特点。但迄今为止,仅从木榄中分离到一种黄酮类化合物。在前期研究过程中,本课题组从木榄叶片中分离到4种黄酮类化合物,其中一种为新化合物(已申请专利),另外三种为木榄属植物中首次报道。初步的研究显示:这些黄酮类化合物的含量在不同木榄群落中具有较为明显的差异,揭示这些差异与环境因子(如:温度、盐度、pH以及降雨量等)的相关性将有助于为对木榄这种具有潜在药用价值的盐生植物的合理开发利用提供理论依据。本研究对不同红树群落来源以及同一红树群落中处于不同生长季节的木榄叶片中总黄酮含量的变化进行了分析,结合多因素统计分析方法比较了这些化合物含量与环境因子的相关性。结果证明木榄叶片中黄酮类化合物的产生和蓄积主要受到环境中年均气温的影响,其在一年中的动态变化与温度呈现出明显的负相关性。1材料和方法1.1样品的采集和处理木榄[B.gymnorhiza]样品采集于广东省湛江市特呈岛(Techeng,N21º17′,E110º22′)和高桥(Gaoqiao,N21º55′,E109º74′)、广西省山口红树林保护区(Shankou,N21º51′,E109º66′)以及海南省的东寨港红树林保护区(Dongzhai,N19º98′,E110º52′)、文昌头苑(Wenchang,N19º62′,E110º74′)和三亚(Sanya,N18º14′,E109º51′)等地的红树群落。在每个红树群落中选择一块100×100m2样方,在样方内随机挑选20~30株木榄,并从每株木榄上取下成熟叶片,按不同地区分类保存备用。样品采集时间为2005年3月~2006年12月,于每月25~30日间采样。采样时,采样地区要求连续1周未降雨。木榄材料由海南东寨港红树林保护区的钟才荣鉴定,植物凭证标本保存于中国药科大学海洋药用生物资源学教研室。1.2采样点的经度和自由度年平均气温、年降雨量、年日照时间和月平均气温收集于采样地区的林业和农业部门。采样点的经度和纬度用美国Garmin美洲豹GPS12测定,采样时的温度、湿度和土壤盐度等分别于2005年3月28~4月2日和2006年3月25~3月31日间测定,两次测定数据基本稳定(表1和表2)。1.3丁标准液的配制标准品芦丁(Rutin)由本实验室制备,纯度为99.2%,经105℃下干燥至恒重后,准确称取3.5mg,于适量蒸馏水中加热溶解,定容至25mL,制成浓度为0.14mg⋅mL-1的芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL,分别加到10mL容量瓶中,再加入5%的NaNO2溶液0.3mL,放置5min后,加入10%的Al(NO3)3溶液0.3mL,摇匀后放置6min,继续加入1mol⋅L-1的NaOH溶液2mL,加水定溶至10mL,于510nm处分别测定吸光度A510值,得芦丁质量(Y,mg)与吸光度A510间的回归方程:Y=0.027+0.9916A510(r2=0.9939),根据此方程,总黄酮含量在0~0.84mg范围内与吸光度A510呈良好线性关系。1.4总黄酮提取液的制备从每个红树群落样品中随机取20株木榄植株的新鲜叶片,用蒸馏水冲洗干净后混合,50℃烘72h,将叶片粉碎并过100目筛。精密称取0.5g粉末若干份,按不同提取溶剂、提取方式进行考察。将样品放入圆底烧瓶中,加入50mL溶剂进行提取,过滤得滤液,再将滤渣用甲醇洗3遍,合并滤液并蒸干,加入100mL水制成总黄酮提取液。取2mL样品,按以上测标准曲线的方法测黄酮总含量,以总黄酮量(mg)占每克干重(g)的比值表示。1.4.1总黄酮含量的优化80℃加热回流2h,对甲醇、乙醇和80%甲醇3种溶剂进行了优化,总黄酮含量分别为(82.5±0.2)、(76.8±0.2)和(55.6±0.2)mg⋅g-1,可见甲醇提取最完全,故用甲醇作提取液进行后续进一步考察。1.4.2总黄酮含量的测定对甲醇索氏提取、80℃加热回流、超声提取2h进行了考察。总黄酮含量分别为(72.3±0.3)、(82.5±0.2)和(82.2±0.2)mg⋅g-1,加热回流和超声提取效果接近,但加热回流提取更完全。1.4.3总黄酮含量的测定采用甲醇80℃加热回流,对提取时间为1、2、3h分别进行了考察,总黄酮含量分别为(82.6±0.3)、(82.5±0.3)和(81.7±0.2)mg⋅g-1,因此,1h的提取已经完全。综上研究结果,确定木榄叶片中总黄酮的最佳提取条件为甲醇80℃加热回流提取1h。1.5总黄酮含量测定精密称取木榄叶片粉末500mg左右,平行6份,按最佳条件制备供试品溶液,以外标法计算总黄酮含量(mg⋅g-1),分析测定结果的RSD值。重复性结果表明木榄叶片中总黄酮平均含量为82.4mg⋅g-1,RSD为0.2%。1.6精密度测试精密称取木榄叶片粉末500mg左右,平行6份,按最佳条件进行检测,RSD为1.5%,表明本法精密度良好。1.7返回率测试精密称取木榄叶片粉末500mg左右,平行6份,按最佳条件进行检测,总黄酮平均加样回收率为102.1%,RSD为1.8%。1.8环境因子对红树群落聚类分析和经济效益的影响数据以2005年度和2006年度测定数据的平均值±SD表示。以总黄酮含量为变量,用SPSS11.5软件对不同红树群落中的木榄样品作聚类分析。将盐度、年均气温、采样温度、相对湿度、年降雨量和年日照时间与总黄酮含量作相关分析,分别求出其相关系数r,对于显著相关的环境因子,以其为变量X,总黄酮含量为Y,进行一元回归分析,求出在环境因子变化的情况下,总黄酮含量在正态回归情况下的期望值为Y=a+bX。对数据进行F检验,以P<0.05为显著性差异。2结果2.1不同红树群落木榄聚类分析不同红树群落来源的木榄叶片总黄酮含量呈现出显著的差异(图1A)。海南3个红树群落,即:东寨港、文昌和三亚群落中木榄的总黄酮含量较低,明显低于广东高桥、特呈岛及广西山口红树群落的木榄。在所有6个红树群落中,以山口群落中的木榄总黄酮含量最高,达到55.4mg⋅g-1,而海南三亚群落中木榄的总黄酮含量最低,只有15.9mg⋅g-1(图1A),两者间相差约3.5倍。根据总黄酮含量的变化情况,对6个红树群落中的木榄进行了聚类分析,结果6个红树群落中的木榄可聚为2组,其中海南东寨港、文昌和三亚群落为Ⅰ组,广东的高桥、特呈岛及广西的山口群落为Ⅱ组(图1B)。Ⅰ组和Ⅱ组间的总黄酮含量差异平均约为2.7倍。上述聚类结果体现了木榄叶片中总黄酮含量的地域分布特点,即:随着纬度的降低,总黄酮的含量总体上呈现出下降的趋势(表1)。2.2响应面回归分析表1,表4根据6个红树群落中的各个环境因子数据(表1)和木榄叶片中总黄酮含量(图1A)分析结果,利用SPSS11.5软件对环境中影响总黄酮含量变化的主因子进行了分析(表3)。经显著性检验,6个红树群落中木榄叶片总黄酮含量与年均气温呈现明显的负相关(r=-0.903,P=0.014),木榄叶片总黄酮含量(Y)和年均气温(X)之间的回归方程为:Y=350.191-13.435X,r=-0.903。统计分析结果同时显示:木榄叶片中总黄酮含量的变化与环境中的盐度、采样温度、相对湿度、年降雨量、年日照时间和土壤pH之间无显著相关性(P>0.05)。2.3不同季节动态红树群落木榄叶片总黄酮含量的变化对2005年3月至2006年12月间采自海南文昌和东寨港红树群落中木榄叶片总黄酮含量的变化进行了分析,结果显示:文昌和东寨港红树群落中木榄叶片总黄酮含量分别在12月份和11~12月份(未采集到文昌红树群落1、2、11月份及东寨港红树群落1、2、7、10月份的木榄样品)达到最高,两个红树群落中木榄叶片总黄酮含量在3~9月份明显偏低(图2)。上述变化与产地气温的变化之间可能有一定的联系,资料显示:这两个产地以12月和1月气温最低,而在2月份后气温逐渐回升,至7-9月份达到最高(表2)。3温度和温度对木榄叶片总黄酮含量的影响黄酮作为植物次生代谢产物,其在植物体内的含量受到多种环境因子(如:温度、盐度、光照以及水分等)的影响。本文的研究结果证明木榄叶片中总黄酮含量与年均气温呈负相关性,这可能与较低的温度有利于黄酮类物质的积累有关。尽管有大量的研究显示:黄酮类化合物的生物合成途径在盐胁迫条件下有明显加强的趋势,但本研究中并未检测到木榄叶片中总黄酮含量的变化与环境中盐度的变化呈现明显的相关性(r=0.237,P=0.652)。同时,木榄叶片中总黄酮含量的变化与其环境中的其它环境因子(如:采样温度、相对湿度、年降雨量、年日照时间以及土壤pH等)也没有显著的相关性,这与其它一些报道不一致,其原因有待进一步分析。对海南两个红树群落(文昌和东寨港)中木榄叶片总黄酮含量季节变化规律的分析结果显示:较低的气温可能有利于木榄叶片中黄酮类化合物的合成和蓄积。大量的研究显示:黄酮类化合物的合成受到其生物合成途径中多种转录激活因子(如:C1-Myb等)