响应面法优化枸杞无硫促干护色工艺及其对品质的影响

响应面法优化枸杞无硫促干护色工艺及其对品质的影响

王晓雨，任贵平，程竹林，曹龙洲，黄文书,2,，杨海燕,2（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆果品采后科学与技术重点实验室，新疆乌鲁木齐830052）枸杞（L.）为茄科枸杞属植物，其果实1～2cm，为明亮的橙红色椭球浆果，属于国家卫健委公布的药食同源品种，在我国和其他的亚洲国家有2000多年种植和使用历史。枸杞含有多种活性化合物，包括酚类、类胡萝卜素和多糖，具有抗衰老、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、神经保护和细胞保护等多种生物活性。我国枸杞资源丰富，市场需求量大，具有广阔的开发前景。然而，由于鲜食枸杞的水分和糖分含量较高，采后组织易受到机械损伤和微生物感染，鲜果难以进入市场，大多以干燥的方式进行加工出售，干燥是防止微生物腐败和发生化学反应、保藏果蔬的有效方法。农户多采用晒干的方式干燥枸杞，但晒干会有干燥效率低、受微生物污染和虫害等缺点。目前已将多种机械干燥方法，如热风干燥、微波干燥、真空干燥和冷冻干燥等应用于枸杞。其中，热风干燥是机械干燥枸杞中应用最广泛的方法。鲜枸杞的热风干制速率较慢，主要是因其表面附着的蜡质层阻止枸杞内部水分向外界扩散，从而影响干制效果。为缩短枸杞的干制时间，可在干制前对枸杞进行适当的脱蜡预处理。在前人的研究中，在空气对流干燥前对枸杞表面进行物理磨损预处理，这种处理在一个装有砂纸的机动滚筒内进行，用于去除枸杞表面的蜡质层，有助于减少枸杞干燥所需要的时间和能量。在传统工艺中，农户普遍使用较高浓度的碳酸钠作为脱蜡剂，使其蜡质层被破坏，以形成新的水分子传递途径，从而加快枸杞的干燥速度。然而，枸杞在干制过程中易受到酶促褐变和非酶褐变的影响而发生褐变反应，导致枸杞干制品色泽劣变。若单独使用脱蜡剂，虽缩短了干制时间，但难以长期保持枸杞的鲜红色泽。关于枸杞护色方法的研究报道较少，果蔬的护色大多使用硫护色。亚硫酸盐能够有效抑制酶促褐变和非酶褐变，可延缓或抑制褐变发生。其护色效果虽好，但二氧化硫的残留会影响产品风味，对人体健康也存在一定的危害。因枸杞在干制过程中易发生褐变反应，导致外观品质和营养价值的损失。因此，为提高枸杞的干燥效率、色泽和营养品质，需研究开发一种无硫促干护色方法，即采用脱蜡剂碳酸钠和无硫护色剂结合使用的方法以达到促干护色效果。综上所述，为使枸杞同时达到干制速度快、干制品色泽鲜艳的效果，将枸杞的“促干”和“护色”过程同时进行。本研究以新鲜枸杞为原料，以未处理的枸杞为对照，筛选出最适的枸杞促干护色方法，并对较佳的方法进行工艺优化，确定适宜的加工工艺。探究不同促干护色方法对枸杞促干护色效果及干制产品品质的影响，对节约能源和提升枸杞的经济价值具有重要作用，可为实际生产提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器鲜枸杞2021年8月采自新疆精河县，品种为宁杞9号，试验选取无霉变，无机械损伤，成熟度与颗粒大小均一的果实；-胡萝卜素、没食子酸标准品（≥98%），上海源叶生物科技有限公司；芦丁标准品（95%），国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂北京索莱宝科技有限公司；碳酸钠、柠檬酸食品级，河南万邦化工科技有限公司；葡萄糖、硫酸、苯酚、丙酮成都市科隆化学品有限公司；蒽酮上海科丰化学试剂有限公司；乙酸锌、亚铁氰化钾天津市北联精细化学品开发有限公司；冰乙酸、无水乙醇、石油醚、二氯甲烷天津市鑫铂特化工有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠天津市致远化学试剂有限公司；以上均为国产分析纯；商业促干剂：翠绿牌枸杞促干剂新疆乌鲁木齐市格瑞德保鲜科技有限公司提供。DHG-9420A型电热恒温鼓风干燥箱上海申贤恒温设备厂；IKAA11基本型研磨机广州仪科实验室技术有限公司；SF-GL-16A型高速冷冻离心机上海菲恰尔分析仪器有限公司；T6新世纪紫外分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；LE204E型电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JEA202型电子天平上海浦春计量仪器有限公司；DHS-16型水分测定仪上海菁海仪器有限公司；NH-A-1808型高品质电脑色差仪深圳市三恩时科技有限公司；DZKW-型电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器厂；KQ-300TDE型高频数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司。1.2实验方法1.2.1样品预处理将新鲜枸杞放入不同促干护色溶液中浸泡10min，取出沥干表面水分，并置于50℃热风干燥箱中干燥。经预实验发现，枸杞在干制42h时已达到干制标准（≤13%），因后期试验组数较多，难以严格控制各组干制所需具体分钟数，本试验将所有处理组干制至同一时刻（42h）取出，测定其水分含量和色泽。1.2.2促干护色剂的组成前期预实验已对碳酸钠浓度、复合促干护色液浓度和柠檬酸钠浓度进行梯度筛选，为交互验证促干护色液的效果，需统一所有浓度，具体组成见表1。表1促干护色液组成Table1Compositionofdry-promotingcolorprotectingliquid1.2.3促干护色工艺的优化1.2.3.1单因素实验因枸杞表皮存在蜡质层，单独使用柠檬酸难以起到护色作用，考察单因素时，需将脱蜡剂碳酸钠与护色剂柠檬酸复合使用，利于护色剂柠檬酸的渗入。采用控制变量法，考察碳酸钠浓度（0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）、柠檬酸浓度（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%）、浸泡时间（0、5、10、15、20min）和浸泡温度（30、40、50、60℃）对枸杞促干护色效果的影响。考察某一因素时，其他因素条件固定为：碳酸钠0.9%，柠檬酸0.6%，浸泡时间10min，浸泡温度30℃。1.2.3.2响应面试验优化根据单因素实验结果进行响应面试验，以碳酸钠浓度、柠檬酸浓度和浸泡时间为研究因素，以枸杞干制后的含水量和色差值为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验，因素水平设计见表2。表2响应面试验因素水平设计Table2Factorleveldesignofresponsesurfacetests1.2.4指标测定1.2.4.1含水量的测定采用快速水分测定仪测定枸杞干制后的水分含量。将枸杞充分粉碎，称取5g左右置于水分测定仪称量盘中，按下启动键，待仪器提示后记录数据即可。注意样品堆积平整，利于水分完全蒸发。1.2.4.2色泽的测定采用色差仪测定枸杞干制后的色泽。用总色差值Δ表示待测样品的色泽（）与鲜样色泽的（）的差异。Δ计算方法如式（1）所示，表示整体颜色变化：式中：值分别表示干样和鲜样的明度；值分别表示干样和鲜样的红绿度；值分别表示干样和鲜样的黄蓝度，Δ为总色差值。1.2.4.3枸杞多糖含量的测定参考GB/T18672-2014《枸杞》中的方法测定枸杞多糖含量。1.2.4.4总糖含量的测定采用蒽酮比色法测定枸杞中总糖含量。并稍作修改。称取2.00g枸杞粉末于250mL锥形瓶中，加入100mL蒸馏水，5mL乙酸锌和5mL亚铁氰化钾溶液，沸水浴加热10min，定容至250mL容量瓶中，待静置至上清后过滤。吸取提取液2mL于20mL具塞比色管中，沿管壁加入蒽酮试剂10mL，立即摇匀，放入沸水浴中加热10min，取出后迅速冷却至室温，避光放置10min，于620nm波长下测定吸光度。同法制备不同浓度葡萄糖标准溶液，所得标准曲线线性方程为：y=0.0055x+0.0134，²=0.9984。由此计算样品总糖含量（以葡萄糖计，%）。1.2.4.5总类胡萝卜素含量的测定参考艾百拉·热合曼等的方法测定枸杞中总类胡萝卜素含量。标准曲线的制作：精密称取-胡萝卜素标准品4mg，用少量二氯甲烷溶解，用石油醚-丙酮混合液（体积比4:1）定容至50mL棕色容量瓶中，充分混匀后分别量取1、2、3、4、5、6mL于10mL棕色容量瓶中，用石油醚-丙酮混合液（体积比4:1）定容，于448nm波长下测定吸光度，所得标准曲线线性方程为：y=0.0052x-0.0035，=0.9908。样品的测定：将枸杞粉碎均匀，称取1g样品（精确到0.0001g），按料液比1:15（m/v）加入15mL石油醚-丙酮混合液（体积比4:1），于室温条件下超声提取3次，每次超声20min，过滤后合并滤液，滤渣用石油醚-丙酮混合液洗涤数次至滤液无色，并定容至250mL棕色容量瓶中，于448nm波长处测定吸光度，按照标准曲线方程计算类胡萝卜素含量。在整个实验过程中需要保持避光。1.2.4.6总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法测定枸杞中总酚含量。并稍作修改。将枸杞粉碎均匀后称取2.00g置于250mL锥形瓶中，加入40mL60%（体积分数）乙醇溶液，混匀后于70℃水浴50min。提取液在4℃下10000r/min离心15min。取1mL上清液加入1mL福林酚试剂，摇匀，再加入质量分数12%的NaCO溶液2mL，用蒸馏水定容至25mL并摇匀，在室温下避光反应2h，于765nm波长下测定吸光值。以没食子酸为标准品，同法制备不同浓度标准溶液，所得标准曲线线性方程为：y=4.7429x+0.0075，=0.9986，由此计算样品总酚含量（mg/g）。1.2.4.7总黄酮含量的测定采用硝酸铝显色法测定枸杞中总黄酮含量。并稍作修改。称取2.00g枸杞粉末置于250mL锥形瓶中，加入40mL60%（体积分数）乙醇溶液，混匀后于70℃水浴50min，再置于300W超声波下辅助提取30min。提取液在4℃下以10000r/min离心15min。取10mL提取液于25mL容量瓶中，加入0.5mL5%的NaNO溶液，摇匀后放置6min，再加入0.5mL10%的Al（NO）溶液，摇匀后放置6min，再加入4mL4%的NaOH溶液，用30%乙醇溶液定容，摇匀后放置10min，于510nm波长下测定吸光值。以芦丁为标准品制备不同浓度标准溶液，所得标准曲线线性方程为：y=0.0118x-0.0038，=0.9992，由此计算样品总黄酮含量（mg/g）。1.3数据处理每个试验重复3次；采用SPSS26进行数据分析，单因素方差分析方法进行显著性分析；采用Origin2019b制图；采用DesignExpert12软件进行响应面设计；试验数据以平均值±标准差表示。2结果与分析2.1不同促干护色剂的效果对比色泽和含水量可以直观地反映鲜枸杞的促干护色效果，不同促干护色处理的鲜枸杞色泽和水分含量见图1。由图1可知，对照组（处理组1）的色差值与处理组7差异不显著（＞0.05），与其余处理组差异显著（＜0.05）；处理3的色差值和水分含量最低，相比对照组，11种处理对鲜枸杞的促干护色均有显著效果（＜0.05）；在色泽中，处理组3、9、13之间无显著差异（＞0.05），优于其他处理，处理组3的色差为11.31，最接近鲜果的颜色。在水分含量中，处理2、3、4和9间无显著差异（＞0.05），处理3的水分含量最低，为11.02%，相对其他处理干燥速度更快。综合水分含量和色泽，处理3的促干护色效果较佳，即碳酸钠和柠檬酸复合处理对鲜枸杞促干护色效果最好，因此，对此处理组进行后续实验。图1不同促干护色方法的选择Fig.1Selectionofdifferentmethodsforpromotingdrynessandcolorprotection2.2单因素实验结果2.2.1碳酸钠对枸杞促干护色的影响碳酸钠常用作脱蜡剂，配制一定浓度的碳酸钠溶液对鲜枸杞进行淋洗或浸泡，可以显著提升枸杞的干制效率。色差反映出经促干护色干燥后得到的枸杞与鲜果之间颜色的差异。由图2可知，随着碳酸钠浓度的增高，干枸杞的色差值减小，而水分含量则随着碳酸钠浓度增加呈现缓慢下降的趋势。说明碳酸钠具有一定的促干护色效果，Ni等研究发现，对枸杞进行碱液预处理可加快枸杞的干制速度，并使其保持良好的品质。李朋亮也发现在枸杞表面涂抹碳酸钠作为脱蜡剂，可显著提高枸杞的干制速度。当碳酸钠浓度增至0.9%，此时干枸杞的色差值为11.11，而水分含量不再继续下降，但与1.2%和1.5%时无显著差异（＞0.05），综合色差值和水分含量，选择0.9%的碳酸钠溶液作为促干护色液响应面试验的中心点。图2碳酸钠浓度对ΔE和水分含量的影响Fig.2EffectofsodiumcarbonateconcentrationonΔEandmoisturecontent2.2.2柠檬酸对枸杞促干护色的影响由于枸杞表面覆盖了蜡质层，使护色剂难以渗入枸杞内部，所以单独使用柠檬酸时难以达到护色作用，需将柠檬酸与碳酸钠复合使用，使护色效果更加明显。由图3可知，随着柠檬酸浓度的增大，干枸杞的色差值呈先下降后上升的变化趋势，并在其浓度为0.6%时达最低值；水分在其浓度超过0.2%时，无显著差异（＞0.05）。柠檬酸广泛使用在各类果蔬的护色中，碳酸钠主要起促干作用，而柠檬酸是金属离子螯合剂，可以螯合Cu、Mg和Fe等多价金属离子，使酶的催化活性下降。若柠檬酸浓度过高，pH过低，对金属离子的螯合作用较弱，也会导致产品口感偏酸。当柠檬酸浓度增至0.6%，此时干枸杞的色差值为10.32，而水分含量在各浓度之间无显著差异（＞0.05），综合色差值和水分含量，选择0.6%的柠檬酸溶液作为促干护色液响应面试验的中心点。图3柠檬酸浓度对ΔE和水分含量的影响Fig.3EffectofcitricacidconcentrationonΔEandmoisturecontent2.2.3浸泡时间对枸杞促干护色的影响在上述单因素的基础上，固定碳酸钠和柠檬酸浓度，考察浸泡时间对鲜枸杞促干护色效果的影响。由图4可知，随着浸泡时间的增加，各水分含量之间无显著差异（＞0.05），说明浸泡时间对鲜枸杞的促干效果影响不显著；但在色泽中，浸泡5min和浸泡10min时色差值呈显著差异（＜0.05），而浸泡超过10min时无显著差异（＞0.05）。浸泡时间增加，有利于护色剂柠檬酸渗入枸杞果实内部，使之达到更好的护色效果。在浸泡10min时，干枸杞的色差值较低，更接近鲜枸杞的颜色。综合色差值和水分含量，选择浸泡时间为10min作为促干护色液响应面试验的中心点。图4浸泡时间对ΔE和水分含量的影响Fig.4EffectofsoakingtimeonΔEandmoisturecontent2.2.4浸泡温度对枸杞促干护色的影响在上述单因素基础上，固定碳酸钠浓度、柠檬酸浓度和浸泡时间，考察浸泡温度对鲜枸杞促干护色效果的影响。由图5可知，随着浸泡温度升高（30～50℃），各色差值之间无显著差异（＞0.05），浸泡温度为30℃时，水分含量已达到国标规定的13%以下，说明升高浸泡温度对鲜枸杞的促干作用影响不大；当浸泡温度为60℃时，色差值显著上升（＜0.05），水分含量显著下降（＜0.05），鲜枸杞在高温浸泡下，果皮出现大面积开裂现象，一方面加快枸杞内部水分散失，同时也加速枸杞发生酶促褐变反应，导致枸杞干制后颜色劣变。综合考虑，选择室温30℃作为固定条件，后期不再进行优化。图5浸泡温度对ΔE和水分含量的影响Fig.5EffectofimmersiontemperatureonΔEandmoisturecontent2.3响应面试验结果根据单因素实验结果，以枸杞干制后的水分含量（Y）和色差值（Δ，Y）为响应值，以碳酸钠浓度（A）、柠檬酸浓度（B）和浸泡时间（C）为自变量，进行三因素三水平的响应面优化试验。实验方案及结果见表3。2.3.1回归方程拟合及方差分析通过DesignExpert12软件对表3中的试验结果进行响应面回归分析，得到该实验的回归模型方程。表3响应面实验设计方案及结果Table3Responsesurfaceexperimentaldesignplanandresults回归模型方程Y=12.80-0.8171A+0.0488B+0.1583C+0.4242AB-0.1150AC-0.2600BC+0.7318A+0.0501B+0.3859C回归模型方程Y=+12.35-1.97A-0.4323B-0.5785C-0.2627AB+0.0494AC+1.09BC+0.7998A+0.9328B+1.54C响应值YY模型系数显著性结果和方差分析结果见表4、表5。表4Y1的回归模型方差分析和系数显著性检验Table4Y1regressionmodelanalysisofvarianceandcoefficientsignificancetest表5Y2的回归模型方差分析和系数显著性检验Table5Y2regressionmodelanalysisofvarianceandcoefficientsignificancetest由表4所示，Y的回归模型值为0.0008，说明该模型的回归方程极显著。失拟项值为0.1765＞0.05，失拟项不显著，无失拟因素存在。此模型的为95.21%，说明模型的拟合度较好，可用该回归方程对试验结果进行分析和预测。在回归模型中，A和A对水分含量影响极显著（＜0.01）；AB和C对水分含量影响显著（＜0.05）；其余对水分含量影响不显著（＞0.05），由此表明各个试验因子与响应值之间的关系不是简单的线性关系。结果显示，各因素对响应值Y的显著性排序为A＞C＞B。由表5所示，Y（色差值）的回归方程模型极显著（=0.0011＜0.01），失拟项不显著（=0.1081＞0.05），此模型的为94.77%，表明该模型与实际拟合良好，实验方法可靠，失拟项不显著说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例较小，可用此模型对鲜枸杞促干护色效果进行分析和预测。该模型中A和C对色差值的影响极显著（＜0.01），CBCA和B对色差值的影响显著（＜0.05）；结果显示，各因素对响应值Y的显著性排序为A＞C＞B。2.3.2响应面图分析根据响应值的3D曲面图（图6～图11），分析各因素对鲜枸杞促干护色效果的影响及各因素之间的交互作用。根据各指标与两个自变量间的等高线和响应面形状，可以反映交互作用是否显著，揭示交互项对枸杞促干护色效果的影响。由图6可知，碳酸钠（A）和柠檬酸（B）的响应面图坡度较为陡峭，等高线图趋于椭圆，说明AB间的交互作用对枸杞促干护色效果的影响达到显著水平，这与方差分析结果一致；碳酸钠浓度越高，枸杞水分含量越低，干燥速度越快，可适当调整A和B的浓度，有利于提高枸杞的干燥速度，降低色差值。图6碳酸钠与柠檬酸对水分含量的作用图及等高线图Fig.6Theeffectdiagramandcontourdiagramofsodiumcarbonateandcitricacidonwatercontent图7碳酸钠与浸泡时间对水分含量的作用图及等高线图Fig.7Theeffectdiagramandcontourdiagramofsodiumcarbonateandimmersiontimeonwatercontent图8柠檬酸与浸泡时间对水分含量的作用图及等高线图Fig.8Theeffectdiagramandcontourdiagramofcitricacidandsoakingtimeonwatercontent图9碳酸钠与柠檬酸对ΔE的作用图及等高线图Fig.9TheeffectdiagramandcontourdiagramofsodiumcarbonateandcitricacidonΔE图10碳酸钠与浸泡时间对ΔE的作用图及等高线图Fig.10TheeffectdiagramandcontourdiagramofsodiumcarbonateandsoakingtimeonΔE图11柠檬酸与浸泡时间对ΔE的作用图及等高线图Fig.11TheeffectdiagramandcontourdiagramcitricacidandsoakingtimeonΔE图9至图11所示为各因素的交互作用对鲜枸杞护色效果的影响。其中图11的响应面相更加陡峭，等高线图呈现椭圆形，说明柠檬酸（B）和浸泡时间（C）之间的交互作用较明显，对枸杞的护色效果达到显著水平，与方差分析结果相符；枸杞的色差值随着柠檬酸浓度的升高和浸泡时间的升高而降低，可适当调整因素B和C，有利于降低枸杞的色差值。2.3.3验证试验采用DesignExpert12软件进行模型分析得出，当碳酸钠浓度为1.142%，柠檬酸浓度为0.576%，浸泡时间为10.486min时，其理论水分含量和色差值均最低，水分含量为12.585%，色差值为11.32，此条件下枸杞的促干护色效果最佳。考虑到试验的可操作性，确定最佳的无硫促干护色工艺为：碳酸钠1.1%、柠檬酸0.6%、浸泡时间为10min。对该条件进行验证试验，做3次平行，得到水分含量12.41%，与预测值12.585%的相对误差为1.39%，色差值11.09，与预测值11.32的相对误差为2.03%，证明该模型可行。2.4促干护色工艺对枸杞品质的影响将3组不同处理的枸杞含水量降至13%以下，进行各项品质指标的测定，探究不同处理方法对枸杞的外观品质和营养品质的影响。由表6可知，两种脱蜡处理的色差值无显著差异（＞0.05），但