玉米芯提取木聚糖及其酶促反应温度的研究

玉米芯提取木聚糖及其酶促反应温度的研究

大自然最常见的现象是硬木植物和其他植物（如水稻、谷物、草本植物等）中的木聚糖。半养分木聚糖。通过共价键和非共价键的连接而形成的木聚糖、纤维素和木质素是构成植物细胞壁的主要结构,木聚糖在被子植物来源的硬木质中,占植物细胞壁总量的15～30%。木聚糖是一种通过β-1,4-糖苷键连接β-D-吡喃型木糖单元而构成主链的异质多糖。大部分木聚糖是异型多糖,主链或侧链上带有多种不同的取代基。常见的取代基有葡萄糖醛酸、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸、α-L-阿拉伯呋喃醛酸、乙酰基、阿魏酰基和p-香豆酰基[4、5]。经酶水解可生产国际市场上急需的低聚木糖、木糖等疗效食品[6、7]。木聚糖作为生产木聚糖和木糖的原料是十分重要而必须的,但实际上商品木聚糖十分昂贵,无法作为生产原料,这时就需要探讨量足价廉的木聚糖的生产方法。此文通过碱解玉米芯这两种容易获得的原料而得到木聚糖,为后续酶解木聚糖得到木寡糖提供了基础。近来,木聚糖被看成是最重要的可再生资源之一,是因为它对通过化学修饰反应而得到的新生物多聚体材料以及功能聚合物有着重要的基础作用[8、9]。木聚糖也因为其中功能分子的多样性的应用潜力无限而被看好,木聚糖及其衍生物最有可能产生的重要的应用便是药物载体、伤口敷料以及造纸业中的添加剂。另外,木聚糖在食品中可用作乳化剂及膳食纤维,具有促进有丝分裂及免疫调节等功能[11、12]。文中以玉米芯为原料,通过碱法抽提获得木聚糖,由玉米芯所得的木聚糖经过过氧化氢脱色,三氯乙酸脱蛋白,得到进一步的纯化,收得率较高,为后续用自提木聚糖酶解得到木寡糖提供了很好的原材料,简化了为木寡糖的提取而需要的的纯化步骤。并且通过对不同来源的木聚糖的米氏常数比较以及最适酶促反应温度的对比,表明从玉米芯提取所获得的木聚糖具有一定的取代性。这一研究在可再生半纤维素资源的开发利用中具有重要意义。1材料和方法1.1木聚糖酶液的制备原料:玉米芯:河南,粉碎成直径0.2mm及以下的颗粒。木聚糖酶液:发酵液8000×离心10min除去沉淀,上清液为木聚糖酶液。桦树木聚糖(Sigma,X0502),山毛榉木聚糖(Sigma,X4252),燕麦木聚糖(Sigma),盐酸,3,5—二硝基水杨酸(DNS)溶液,乙酸,次氯酸钠,氨水,氢氧化钠,过氧化氢,三氯乙酸,乙醇。1.2仪器设备和分析方法SB-10A粉碎机速邦500g多功能粉碎机;SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵上海东玺制冷仪器设备有限公司;HH-2恒温水浴锅金坛市科兴仪器厂;152型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司;85-2恒温磁力搅拌器金坛市科兴仪器厂;FD-1D-50冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司。1.3方法1.3.1木聚糖的提取将玉米芯烘干后粉碎成0.2mm大小左右的颗粒,称取40g玉米芯加入400ml蒸馏水,120℃高温预处理30min,过滤取滤渣,将滤渣烘干后,加入400ml15%(w:v)的氢氧化钠溶液,110℃高温蒸煮30min,过滤取滤液,将滤液用30%(w:v)的氢氧化钠做脱色处理,脱色后加入10%(w:v)的三氯乙酸溶液(10:1)脱蛋白,10000r/min离心20min,取上清液,加入浓盐酸调pH值至中性。加入三倍体积的无水乙醇溶液过夜醇沉,8000r/min离心20min得到沉淀即为粗提木聚糖,-20℃冷冻过夜后冷冻干燥得到较纯的木聚糖。玉米芯木聚糖收得率%=所得玉米芯木聚糖(g)/原始玉米芯质量(g)×100%。1.3.2燕麦木聚糖-磷酸缓冲液的制备3.测试米氏常数的方法以燕麦木聚糖为例,其他木聚糖米氏常数的测定方法与其一样(其中自提玉米芯木聚糖中使用的浓度是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%):样品测定:用移液器吸取1.8ml的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%的燕麦木聚糖-磷酸缓冲液,分别打入1支干净的具塞试管,置于电控恒温水箱中,60℃恒温下预热两分钟,加入0.2ml粗酶液,充分混匀,准确反应10分钟,再加入3mlDNS,充分混合,置沸水中煮沸5分钟,然后迅速用冷水将其冷却至室温,在540nm下以空白样对照测定吸光值。每种浓度的燕麦木聚糖-磷酸缓冲液做3个平行实验。结果取其平均值。1.3.3粗酶液用量的确定样品测定:用移液器吸取1.8ml的0.5%桦树和自提玉米芯木聚糖—磷酸缓冲液,分别打入1支干净的具塞试管置于电控恒温水箱中,加入0.2ml粗酶液充分混匀,分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃准确反应15分钟后,拿出再加入3mlDNS,充分混合,置沸水中煮沸5分钟,然后迅速用冷水将其冷却至室温,在540nm下以空白样对照测定吸光值。每种温度做3个平行实验。结果取其平均值。2结果与分析2.1木聚糖的收得率40g玉米芯最后得到木聚糖的总量是9.77g,所以自提玉米芯木聚糖的收得率为24.4%,较高的收得率对以后工业上大量的获得木聚糖有着重要的意义。2.2木聚糖在各种溶剂中的溶解未脱色未脱蛋白得到的自提玉米芯木聚糖颜色相对要深一些,而且后来在配制木聚糖溶液时,未经任何处理的木聚糖基本不能完全溶解,在溶液中有细小的悬浮颗粒,而经脱蛋白脱色后的可以完全溶解成乳白色的木聚糖溶液,和从sigma购买的桦树木聚糖配制出来的溶液就外观上看基本一致。由后续实验结果也可知性质上也是相似的,具有可替代性。2.3聚糖背后的底物和提玉米芯木聚糖的关系木聚糖酶对以燕麦木聚糖为底物测得的Km是5.6044,以山毛榉木聚糖为底物测得的Km是4.1737,以桦树木聚糖为底物测得的Km是3.6273,以自提玉米芯木聚糖为底物测得的Km是7.5302。可以看出自提玉米芯木聚糖米氏常数7.5312与燕麦木聚糖的5.6044比较相近。说明自提木聚糖虽然有杂质,但是依然具有一定的取代性,对那些只是用来做酶的性质比较的实验,可以用其替代需要购买的比较昂贵的木聚糖。2.4试验对比用sigma的桦树木聚糖和自提玉米芯木聚糖检测DSM10635木聚糖酶的最佳酶促反应温度的试验,见图1。从