液相色谱-质谱联用法测定大鼠血浆中木通皂苷d的浓度

液相色谱-质谱联用法测定大鼠血浆中木通皂苷d的浓度

延续是中国传统的中药，来自四川延续植物的延续（singetal.c.y.chengetal.）干燥的根。续断皂苷类成分是续断药材主要活性成分,其中木通皂苷D含量最高。续断皂苷具有促进成骨细胞增殖和分化的作用,口服生物利用度较低,药代动力学方面研究的报道较少。本文用液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)建立了大鼠血浆中药物浓度的测定方法,并检测了木通皂苷D大鼠灌胃给药的血药浓度。1仪器和试剂盒1.1高效液相色谱检测软件3200QTRAP型液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst1.4.2数据处理软件,美国AppliedBiosystem公司;Agilent1100高效液相色谱系统,包括四元输液泵、自动进样器、切换阀,美国Agilent公司;Eppendorf离心机(Eppendorf5415D,德国);YKH-型液体快速混合器,江西医疗器械厂。1.2号:国木通皂苷D标准品(批号:111685-20103,纯度:93.5%),中国药品生物制品检定所;内标替米沙坦对照品(批号074K47102,含量>99.0%),Sigma公司;甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。1.3中国动物部:syxk京雄性SD大鼠,体质量180～220g(北京大学动物部),动物许可证号:SYXK(京)2006-0025,饲养条件:室温21～25℃,湿度50%左右,12h交替照明。2方法和结果2.1%甲醛-甲醇法色谱柱:XDB-C18柱(5μm,150mm×4.6mm,美国Agilent公司);流动相:5mmol/L乙酸铵含0.1%甲酸(A)-甲醇(B),梯度洗脱(表1);流速:1.0ml/min;柱温:35℃;进样量:20μl。2.2木通皂苷z-3-3-菌株白砂糖离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:多重反应监测(MRM);检测方式:正离子检测方式;离子喷射电压:5500V;源内气体1(GS1,N2)压力:50KPa;源内气体2(GS2,N2)压力:55KPa;气帘气体压力:20psi;离子源温度:550℃;木通皂苷定量离子对(m/z):946.4→455.3,定性离子对(m/z):946.4→437.3(DP电压:80V;CE电压:35eV);内标替米沙坦定量离子对(m/z):515.1→276.1(DP电压:35V;CE电压:50eV)。相应的二级全扫描质谱图见图1。2.3溶液的制备2.3.1储存溶液精密称取10mg木通皂苷D标准品,置100ml容量瓶中,加甲醇溶解,并稀释至刻度,配制成100μg/ml的储备液。2.3.2替米沙坦储备液的配制精密称取10mg替米沙坦对照品,置100ml容量瓶中,加甲醇溶解,并稀释至刻度,配制成100μg/ml的储备液,取适量替米沙坦储备液用甲醇稀释至100ng/ml。2.4lc-ms/ms分析精密量取血浆样品50μl置于1.5mlEP管中,分别加入50μl100ng/ml的内标溶液和50μl甲醇溶液,涡旋1min、离心5min(16100×g),取上清液进行LC-MS/MS分析,进样量为20μl。2.5理论与实践的确认2.5.1木通皂苷d标准使用液中色谱分析取空白大鼠血浆样本50μl,按2.4项下操作,进样20μl,得色谱图2-A;将一定浓度的木通皂苷D标准溶液和内标溶液各50μl加入50μl空白大鼠血浆中,依同法进行涡旋离心处理后进样,得色谱图2-B,取大鼠给药后收集的血浆样品,按2.4项下操作,得色谱图2-C。结果表明,内源性物质不干扰木通皂苷D和替米沙坦的测定。2.5.2单次高压离心处理分别取木通皂苷D储备液适量,用甲醇稀释,配制10、30、50、100、200、500、1000ng/ml标准系列溶液,分别加入空白大鼠血浆溶液和内标100ng/ml替米沙坦溶液各50μl,按2.4项下进行涡旋离心处理,取上清20μl在LC-MS/MS中进样。以标准曲线样本的实测峰值面积与各自内标峰面积的比值(Y)对标示浓度(X)加权最小二乘法(1/x2)进行线性回归,得到标准曲线方程为Y=0.000116X+0.000762(r=0.9977),线性范围为10～1000ng/ml,最低定量限为10ng/ml。2.5.3线性关系法对木通皂苷d质量控制单因素试验按2.5.2项下操作,制备浓度分别为30、100、800ng/ml的木通皂苷D质量控制(QC)样品,每浓度6个样本,连续测定3d,根据当日的工作曲线,计算QC样品的测得浓度,计算相对误差(RE)和日内、日间相对标准偏差(RSD)(表2)。2.5.4回收率计算及相关峰面积取空白血浆50μl,制备浓度分别为30、100、800ng/ml的质控样本,每浓度3个样本;同时另取空白血浆50μl,经甲醇沉淀蛋白后将上清液40℃下氮气吹干,加入50μl蒸馏水,再加入相应浓度的质控和内标溶液,处理后进行LC-MS/MS分析,获得回收率样本相应峰面积;以蒸馏水代替空白血浆,按回收率样本前处理方法进行样本前处理,进行LC-MS/MS分析,获得基质效应样本相应峰面积。按下列公式计算:提取回收率=质控样本峰面积/回收率样本峰面积×100%基质效应=(1-回收率样本峰面积/基质效应样本峰面积)×100%木通皂苷D30、100和800ng/ml3个浓度提取回收率分别为(108.1±9.5)%、(95.3±9.9)%和(103.6±8.6)%,内标替米沙坦提取回收率为(96.5±3.2)%。木通皂苷D和内标替米沙坦低、中、高3个浓度的基质效应分别为-8.57%、-1.96%、-3.63%,内标替米沙坦的基质效应为-2.38%。结果显示,血样中木通皂苷D和内标替米沙坦提取回收率均较高且稳定,血样中基质对木通皂苷D和内标替米沙坦的基质效应较小,均不影响准确测定。2.6血浆样本的制备取雄性SD大鼠6只,经口灌胃给予木通皂苷D水溶液,给药剂量为100mg/kg,于20、40min和1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h眼眶取静脉血约0.5ml置于肝素化EP管中,5900×g离心10min,取上清血浆样本50μl,按2.4项下处理,取上清20μl在LC-MS/MS中进样。将实测峰值面积与各自内标峰面积的比值代入上述标准曲线方程,计算血药浓度,平均血药浓度-时间曲线见图3。3色谱条件优化木通皂苷D为皂苷类化合物,大鼠经口灌胃给药生物利用度较低,很难用高效液相紫外检测的方法进行体内血浆样本的分析。LC-MS/MS与之相比具有明显的优越性,检测灵敏度高,专属性强,需用血浆量较少,为木通皂苷D的临床前研究提供了稳定可靠而又方便易行的检测手段。LC-MS/MS法检测血浆样本中木通皂苷D浓度文献报道很少,Li等报道的方法母离子使用[M+Na]+峰。本实验中发现正离子扫描图中无特征分子离子峰,[M+Na]+峰响应最高,但测定结果不稳定。而[M+NH4]+峰响应虽然较[M+Na]+低,但稳定性良好,通过色谱条件的优化可以满足检测要求。皂苷类化合物[M+Na]