苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的基因表达调控作用

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的基因表达调控作用

史密斯等人成功地重组了水稻银杏叶变换率的多角形病毒（acpmv），并在草坪贪婪的夜生动物细胞系统（sm-9）中显示了人类的-干预。随后Maeda等用BmNPV为载体，在家蚕幼虫体内高水平的表达了人的α-干扰素。目前，杆状病毒表达载体系统（Bculovrirusexpressionvectorsystem,BEVS）已得到了广泛应用，被公认为当今基因工程四大表达系统之一（另3种是细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）。1在细胞外源基因表达方面的应用和完善AcNPV是应用最为广泛的杆状病毒表达载体，它是环形双链DNA病毒，含有的碱基对数目为1.3×105bp。具有感染性的病毒进入易感昆虫细胞，感染后期在细胞核内形成的多角体蛋白的启动子具有极强的启动蛋白表达能力，常被用来构建杆状病毒表达载体。目前，用BEVS表达的外源基因已达500种以上，并在基因工程生产蛋白质的研究方面存在巨大潜力。但由于传统BEVS采用转移载体与野生型病毒共转染昆虫细胞，其重组率较低，并需经多轮空斑纯化才能获得重组病毒，这对于利用该系统研究基因结构与功能、表达与调控作用很不方便。近年来，又发展了一些重组病毒筛选的新技术，现将这些新技术作一简单阐述。1.1．线型化病毒的诱导拯救Kittes等将一个限制性酶切位点引入野生型AcNPV多角体蛋白基因内，用限制性内切酶消化野生型病毒DNA，这种线型化的病毒DNA不能在胞内复制出成熟的病毒颗粒，因此，不能感染昆虫细胞，通过同源重组拯救为环状的复制型，才能复活而在昆虫细胞中复制。当它与转移载体共转染昆虫细胞时，如果不发生同源重组就无野生型病毒背景出现，故该系统同源重组率在理论上可达100%。1.2使用击穿载体的检测美国Gibcobrl公司开发的BactoBac杆状病毒表达系统是利用转座原理在大肠杆菌内构建而成的。PfastBac是供体质粒，带有庆大霉素抗性基因(Gen+)。用克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态细胞，该细胞含有杆状病毒穿梭载体和复制子以及来源于PUC质粒的LacZ肽段编码基因。供体质粒中的外源基因在转座酶作用下，干扰LacZ的表达，所以含有重组质粒(Bacmid)的DH10Bac细菌在有IPTG、X-gal的培养板上形成白色菌落。从菌落培养物提取重组质粒DNA，用脂质介导法转染昆虫细胞即可获得重组病毒。该系统缩短了实验的时间，重组病毒筛选也在大肠杆菌中进行，利用抗性基因筛选和PCR鉴定简化了实验程序。南开大学耿朝晖等利用这个穿梭载体系统表达了人的生长激素（humangrowthhormone,hGH），用免疫化学发光法测得转染上清中hGH表达水平可达18mg·L-1，是用传统BEVS方法表达的400倍。中山大学庞义建立了甜菜夜蛾核多角体病毒BactoBac外源基因表达系统。1.3在酵母中的应用杆状病毒只要含有酵母的自我复制序列（autonomousreplicationsepuence,ARS）和着丝粒（centromere,CEN），就可以在酵母中扩增。Patel等构建了含有ARS和CEN的AcNPV，为了便于在酵母中筛选重组病毒，还在病毒DNA中插入URA3和SUP4-0两个基因，作为选择标记。转移载体含有外源基因，其两端侧翼分别是杆状病毒序列和酵母ARS序列。缺乏SUP4-0基因的重组穿梭载体能生长在合适的酵母菌株上，这样能有效地分离重组穿梭载体。该方法虽然省去了传统筛选噬斑的繁琐，但该载体的转染效率不高，并且增加了用蔗糖梯度纯化重组载体的工作量。1.4重组病毒的筛选单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV1）的tk基因产物胸苷激酶（SHV1-tk），能催化核苷酸类似物，将核苷酸类似物转变为有毒的中间体，从而抑制病毒DNA的复制。Godeau等利用tk基因的上述特征，开发出一种新的重组病毒筛选方法。研究表明，HSV1-tk基因对于阴性杆状病毒的筛选是一个很好的标记，AcNPV介导的HSV1-tk的表达导致了病毒复制对核苷酸类似物的敏感性，当药物敏感性通过外源基因置换而丧失时，病毒复制重新恢复，因而可以选择性扩增tk———重组体。郑州大学李杰等将单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因亚克隆于真核表达载体pcDNA3上，成功构建了含该基因的真核表达载体（pcDNA3-tk）并转染食管癌细胞，经RT-PCR检测确定含HSV-tk基因的真核表达载体能在食管癌细胞中表达。1.5．7重组病毒的分离和纯化P1噬菌体编码Cre重组酶，是交换体P1的基因座（locusofcrossoverP1,loxP1）位点。Stricklett等将loxP序列分别引入AcNPV（获vAloz）和转移载体中并在转移载体中引入由p10基因控制的lacZ基因以供筛选。构建携带外源基因的重组病毒可在细胞体外进行。将vAlox和转移载体按一定比例混合，加入Cre酶，两者发生体外定位重组，可将外源基因重组进vAlox。此为可逆酶促反应，将重组病毒转染昆虫细胞，通过挑选蓝色空斑而纯化重组病毒，高达50%的子代病毒为重组病毒。但重组病毒须经多轮空斑纯化。第三军医大学张正丰等采用双质粒共转染293细胞Cre/loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含MCMV启动子、外源基因和SV40PloyA的AdCMV2huCT1和AdCMV2eGFP载体。并且AdCMV2huCT1在大鼠脊髓中特异性表达。1.6使用acnpv基因组作为病毒标记的抗凋亡功能新霉素（neo）是第1个药物筛选杆状病毒的标记。细菌的neo可以解除抗生素G418对野生型病毒的生长抑制作用，因而能恢复AcNPV在细胞中的繁殖。而AcNPV的p35蛋白基因是细胞凋亡抑制基因。当插入AcNPVp35缺失突变体基因组后可以抑制早熟宿主细胞的死亡，增加病毒的产量达1200倍。当这两种基因插入AcNPV基因组作为选择标记时，可以在一个很高的双亲病毒背景下，选择性地扩增重组或突变体病毒。李晓峰等构建了带有neo抗性基因为筛选标记且含有凋亡抑制基因p35的重组质粒p35IEINeo，转化sf9细胞，经G418筛选得到p35IEINeo的sf9细胞系，克隆化培养后命名为sf935，实验证明其具有抗凋亡特性，可提高外源基因的表达水平。尽管新方法层出不穷，但应用最广且最有效的是线性化技术和BactoBac系统，而空斑纯化仍是不可缺少的过程。2关于蛋白质生产中昆虫细胞的培养2.1虫细胞系的建立自从Grace建立第一个昆虫细胞系以来，昆虫的细胞培养技术发展十分迅速，先后建立了420余株传代昆虫细胞系。最初建立的细胞系以血细胞、成纤维细胞为主。现在建立的细胞系主要来源于未发育成熟的组织，如胚胎的卵巢。许多研究者尝试用成熟组织建立细胞系但不易成功，直到1985年Mitsuhashi等才成功的建立了昆虫血球细胞系，目前为止成熟组织的细胞系已建立多株，如As684、TN368、sf21等。2.2构建工程细胞系由于由活体昆虫建立一个新的细胞系既费时又费力，而且很难预测它的实用性以及其生物学特性，所以越来越多的研究人员采用基因工程的方法对已有的细胞系进行改良，建立新的带有目的基因的工程细胞系。GuangyunL用具有p35的表达载体转化sf-9细胞，增殖克隆细胞系并研究了营养缺乏以及分泌碱性磷酸酶（SEAP）和β-半乳糖苷酶的表达。同野生型细胞比较，转化细胞表现了对放线菌素D诱导的凋亡抵抗性增加和明显的营养缺乏抵抗性增加。转化细胞的SEAP表达超过了亲本sf-9。2.3其他源基因表达系统自1962年Grace首次报道建立了传代的昆虫细胞株和昆虫培养基以来，建立昆虫细胞株已成为一种常规的工作，数以百计来自不同昆虫的细胞株得以建立。细胞株就是在单细胞的基础上通过单独培养，重新繁衍成的新的细胞群体，它可以消除未经克隆细胞所具有的异质性，获得遗传背景均一、生物学性状相似的细胞群（细胞株）。在理论上细胞株的形状更优化。用于表达外源基因的杆状病毒载体目前成熟的只有AcNPV和BmNPV两种，利用其它NPV表达外源基因也有一些研究。其中，AcNPV表达系统大量使用的为sf-9和Tn细胞系。来源于草地贪夜蛾的细胞株是大多数以AcNPV为载体的表达研究所应用的细胞株，其中最早并且至今仍在应用的是来源于卵巢组织的sf-21，另一细胞株是sf-9，它是从sf-21中进一步克隆出来的，现也被广泛应用。两种细胞株均可连续传代150代以上。不同的细胞株对外源基因的表达水平不同，电生理研究用的受体表达以sf-9为佳。甘蓝夜蛾来源的Mb细胞对外源基因的表达量比sf-21和sf-9高出2～3倍。但是Mb细胞较sf难培养。来源于粉蚊夜蛾的Highfive，细胞体积较大，容易培养，对外源基因表达量常较sf高，同样为真核表达系统，昆虫细胞与哺乳动物细胞相比，具有许多优点。Sf-21、sf-9、Highfive可悬浮培养，但生长速度较慢。此外，经细胞获得重组病毒后，还可在宿主昆虫幼虫、蛹体内进行表达，是哺乳动物难比拟的。2.4实验细胞的培养利用BEVS表达外源基因，其宿主细胞的种类、培养条件和对表达产物的修饰加工，是直接影响表达水平、表达产物活性和生产可行性的重要因素。目前通用的商品培养基有Grace氏培养基TC-100、IPL-14、TNM-FH、以及经改良的哺乳动物细胞培养基TC199-MK等。这些培养基使用时通常要补充5%～10%胎牛血清和一些未测定的蛋白水解物或抽取物等复杂添加剂。但由于使用胎牛血清价格高，血清中的蛋白影响从培养的上清液中分离和提取重组蛋白，使蛋白的纯化更加困难，所以无血清培养基的研制被提上日程。已先后研制出多种无血清或低蛋白培养基，如SFM-5、CDM、SF-900Ⅱ、EX-CELL405、ISMF、CDC等。3影响生物活性及生产可行性的因素利用BEVS表达外源基因，其宿主细胞的种类、培养条件和对表达产物的修饰加工，是直接影响表达水平、表达产物生物活性和生产可行性的重要因素。这一系统的主要缺点是瞬时表达，病毒感染最终会导致细胞死亡，因此必须重新启动感染，每一轮蛋白质的合成都必须再感染新培养的细胞，这对商品化生产无疑是个缺点。3.1糖基化修饰基因杆状病毒在进化过程中保留或获得了一些非常有利于其繁殖和传播的基因。如胱氨酸蛋白酶和几丁质酶，前者分解虫体的组织让虫体容易腐败，从而利于在环境中传播病毒，后者的大量表达，可以破坏虫体的表皮几丁质结构，使虫体液化，利于再次感染。蜕皮甾体葡萄糖基转移酶基因（egt）的编码产物能使蜕皮激素失活，推迟幼虫入眠，引起幼虫持续取食和生长，增加了感染幼虫的病毒繁殖量，利于病毒的进化。糖基化可以保护蛋白分子免受蛋白酶分解或维护蛋白质的天然构象，是后加工过程中的重要环节。Jarvcss等开发了一套新的表达系统，将糖基化修饰基因置于IE-1启动子控制下，进行表达、修饰昆虫细胞的N-糖基化途径，为生产与哺乳动物细胞表达产物具有相同的N-糖基化蛋白提供了新途径。杆状病毒基因可以修饰并使之在大肠杆菌内像大质粒那样复制，所以可以构建杆状病毒穿梭载体缩短纯化重组杆状病毒的时间。例如商品化的BactoBac系列，在大肠杆菌内产生重组杆状病毒，因此，鉴定与纯化一个重组病毒所用的时间大大缩短，且可快速、同时分离出多个杆状病毒，特别适用于表达不同蛋白变种。3.2昆虫细胞的稳定表达系统目前已经建立的大规模昆虫细胞培养形式有贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等。固定化培养是近来发展的一项昆虫细胞大规模培养新技术，对昆虫细胞而言可有效降低剪切力对细胞的伤害，同时细胞与培液可有效分离，简化了操作步骤，降低了染菌机率。在绝大多数情况，用昆虫细胞生产野生型杆状病毒或用BEVS生产外源蛋白质都是作为间歇过程进行的，所有细胞都因病毒感染而死亡，从而导致高效表达的重组产物的后加工不完全。另一个明显的缺点是经多次连续传代后，出现传代效应，影响了表达效率。以上两点难以克服的困难限制了昆虫细胞规模化培养的发展，迫使人们寻求其它途径，最近Invitrogen开发了一个昆虫细胞的稳定表达系统，对转化细胞的选择标记和启动子作了改进。该系统的特点是用对昆虫细胞具有很好杀死能力的Zeocin作为选择标记，快速纯化稳定转化的细胞系，用黄彬毒蛾核多角体病毒（OpMNPV），即早期基因启动子IE-1构建的商品化载体pIZT/V5-His已进入市场。用此载体仅约2周的时间就可获得非裂解、连续表达的稳定转化昆虫细胞系。3.3丝腺生物反应器蚕体内BEVS系统的外源基因表达虽然表达量高，但它是瞬间的，不能连续高效表达外源产物，迫使人们考虑其解决途径。家蚕丝腺是一个天然的高效生物反应器。如何将目的基因高效导入蚕体内成为解决应用丝腺生物反应器的关键。最近朱江等