高效液相色谱柱发展史课件

第三节高效液相色谱(highperformanceliquidchromatograpphy,HPLC)第三节高效液相色谱液相色谱基础1．色谱图和峰参数★色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。★基线(baseline)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。★噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。★漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。★色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。液相色谱基础1．色谱图和峰参数色谱图色谱图★拖尾因子(tailingfactor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。★峰底-基线上峰的起点至终点的距离。★峰高(peakheight，h)-峰的最高点至峰底的距离。★峰宽（peakwidth，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ★半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ★标准偏差（standarddeviation，σ)-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。★峰面积(peakarea，A)-峰与峰底所包围的面积。★拖尾因子(tailingfactor，T)，用以衡量色谱2．定性参数（保留值）★死时间(deadtime，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。★死体积(deadvolume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）★保留时间(retentiontime，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

★保留体积(retentionvolume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR2．定性参数（保留值）3．柱效参数★理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)---用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用调整保留时间(t‘R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效)。★理论塔板高度(theoreticalplateheight，H)---每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。3．柱效参数4．相平衡参数★分配系数(distributioncoefficient，K)--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。

在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。4．相平衡参数★容量因子(capacityfactor，k)--化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。

容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t‘R）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t‘R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于t‘R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。★选择性因子(selectivityfactor，α)--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α又称为相对保留时间（《美国药典》）。

要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。★容量因子(capacityfactor，k)--化合物在5．分离参数★分离度(resolution，R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当W1＝W2时，R＝1。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。

中国药典规定R应大于1.5。

提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k趋于0时，R也趋于0；k增大，R也增大。但k不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k在1～10范围内，最好为2～5，窄径柱可更小些。5．分离参数HPLC组成示例HPLC组成示例高效液相色谱柱发展史课件高效液相色谱柱发展史课件高效液相色谱柱发展史课件高效液相色谱柱发展史课件高效液相色谱柱发展史课件高效液相色谱柱发展史课件17一、液相色谱分离的基本原理液相色谱方法的分类液相色谱分离方法大致可以分为正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、体积排除色谱、亲和色谱以及手性色谱。在高效液相色谱法中，目前应用得最广泛的是正相色谱和反相色谱，其中反相色谱又是重中之中。液相色谱分离原理正相色谱的分离原理：根据溶质极性的不同而产生的溶质在吸附剂上吸附性强弱的差异而分离。反相色谱的分离原理：根据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。17一、液相色谱分离的基本原理液相色谱方法的分类高效液相色谱法是采用高效填充剂，利用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有填充剂（固定相）的色谱柱进行分离测定的色谱方法。经由进样阀注入的供试品，有流动相带入柱内，各成分在柱内被分离后，依次进入检测器，有记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。二、高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱法是采用高效填充剂，利用高压输液泵将具有不同极性1.流程1.流程2.主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2.主要部件(1)高压输液泵(2)进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(2)进样装置流路中为高压力工作状态，(3)高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(3)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径3.5高效液相色谱的检测器紫外检测器：荧光检测器：蒸发光散射检测器：示差折光检测器：质谱检测器：3.5高效液相色谱的检测器紫外检测器：3.5.1紫外-可见检测器可分为三种类型：固定波长型、可变波长型及二极管阵检测器。

应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

3.5.1紫外-可见检测器可分为三种类型：应用最广，对大部二极管阵列检测器工作原理为：当复光透过流通池后，被组分选择性吸收，透过光具有了组分的光谱特征。此透过光（复光）被光栅分光后，形成组分的吸收光谱，照射到光电二极管阵列装置上，使每个纳米光波的光强变成相应的电信号强度。这种记录方式不需扫描，因此最短能在几个毫秒的瞬间内获得流通池中色谱组分的吸收光谱。二极管阵列检测器工作原理为：高效液相色谱柱发展史课件光源检测室光栅二极管阵列检测UVdetectorcell内容积：1-10l光路长：2-10mm光源检测室光栅二极管阵列检测UVdetectorcell3.5.2荧光检测器荧光检测器是一种很灵敏的,有选择性的检测器,其灵敏度比UV高10~1000倍,。它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测的物质：氨基酸、多糖、维生素等。

紫外检测：UV的测定灵敏度可达10-12mol/L

荧光检测：检测范围在10-12~10-15mol/L

衍生方式：1）柱前衍生：2）柱后衍生：3.5.2荧光检测器荧光检测器是一种很灵敏度高选择性好共轭双键刚性、平面性荧光衍生荧光探针荧光检测器结构示意图灵敏度高荧光检测器结构示意图3.5.3示差折射检测器

通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器原则上凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定，其检测限可达（10-6~10-7）g/mL。由于折射率对温度的变化非常灵敏，大多数溶剂折射率的温度系数约为5×10-4，因此，检测器必须恒温，才能获得精确的结果。折射检测器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。

3.5.3示差折射检测器通过连续监测参比3.5.4蒸发光散射质量检测器

（EvaportivelightScatteringDetector,ELSD)

ELSD的通用检测方法消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，ELSD的响应值与样品的质量成正比，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。示差检测器（RI）也可以说是一种通用型检测器，它灵敏度低，并与梯度脱洗不相容。质谱是另一种通用型检测器，但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的应用。

3.5.4蒸发光散射质量检测器

（Evaportivel在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为I=kmb

式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。

工作原理：在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和（1）用惰性气体雾化脱洗液（2）蒸发光散射检测器流动相在加热管（漂移管）中蒸发（3）样品颗粒散射光后得到检测ELSD检测分为三个步骤：（1）用惰性气体雾化脱洗液ELSD检测分为三个步骤：1)可检测挥发性低于流动相的任何样品；2)流动相低温雾化和蒸发，对热不稳定和挥发性化合物亦有较高灵敏度；3)广泛的梯度和溶剂兼容性，无溶剂峰干扰；4)辅助载气提高了检测灵敏度，保持检测池内的蒸发光散射检测器清洁，避免污染；5)高精度雾化和蒸发温度控制，保证高精度检测；6)可与任何HPLC系统连接。

主要优势1)可检测挥发性低于流动相的任何样品；主要优势ELSDUVRIDMS应用范围通用有光吸收的化合物通用通用响应质量相关化学相关折光度相关质量相关灵敏度高高低高未知物检测能不能能能流动相梯度影响不影响本底影响影响不影响基线稳定性好较好差好ELSDUVRIDMS应用范围通用有光吸收的化合物通1、与示差折光检测器相比灵敏度高对流动相系统温度变化不敏感可进行梯度洗脱2、与光吸收检测器相比：能解决最困难的HPLC检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物检测减低流动相溶剂的纯度要求无需测定定量校正因子蒸发散射质量检测器的优缺点：1、与示差折光检测器相比蒸发散射质量检测器的优缺点：37色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱37色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器四、高效液相色谱法的特点

特点：高压(150~300kg/cm2)、高效(60000理论塔板/米)、高速(1~10mL/min)、高灵敏度（微升数量级）高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。四、高效液相色谱法的特点特点：高压(150~30039高效液相色谱柱发展史19世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10µm的无定型硅胶颗粒。70年代后期，发展了反相液相色谱。80年代，HPLC被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5～10µm球形硅胶。90年代早期，粒径为5µm的高纯硅胶，即所谓的B型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种B型硅胶含有微量的金属。90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了3µm或3.5µm的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于2µm的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的HPLC硅胶基质填料主要为B型硅胶。39高效液相色谱柱发展史19世纪70年代中期，HPLC仪开始40五、HPLC色谱柱及其填料的特征HPLC色谱柱的基质材料硅胶与聚合物现代高效液相色谱填料的特征色谱柱结构固定相键合相色谱柱接头键合相稳定性40五、HPLC色谱柱及其填料的特征HPLC色谱柱的基质材411、硅胶基质材料1.目前应用最为广泛的基质材料。2.高机械强度和高的比表面积。3.可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。4.高效。5.重现性好。6.pH适用范围为pH2－8。7.具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。411、硅胶基质材料1.目前应用最为广泛的基质材料。422、聚合物基质材料交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。pH稳定性好：pH1－13。可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。在中等pH条件下对强碱性物质具有更好的峰形。填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。分离效率相对硅胶而言比较低重现性不好422、聚合物基质材料交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。43硅胶外形的影响无定型硅胶:

最初的HPLC填料粒径>5µm柱床稳定性差比表面积较小价格便宜球形硅胶:

现代HPLC填料粒径小(5µm,3µm,<2µm)重现性好稳定性好分离效率高43硅胶外形的影响无定型硅胶:球形硅胶:44硅胶纯度的影响硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。以前的纯度较低的硅胶（称为A型硅胶）,A型硅胶是以金属硅酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。纯度高、酸性较弱的硅胶(称为B型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。44硅胶纯度的影响硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。45硅胶纯度的影响M+表面金属能与螯合化合物络合

MSiOH内部的金属对表面硅羟基具有活化作用强酸性A型硅胶C18B型硅胶C1845硅胶纯度的影响M+表面金属能与螯合化合物络合M46硅胶孔径的影响孔径作用和效能<60nm对HPLC分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率60–150nm对小分子的分离效果理想(MW<4,000to130,000),例如药物分子、传统的中药和小分子的缩氨酸300–1,000nm对大分子的分离效果理想，如多肽、核苷和高分子>1,000nm对聚合物的分离效果理想，如DNA和生物大分子46硅胶孔径的影响孔径作用和效能<60nm对HPLC47硅胶粒径的影响粒径作用和效能5µm目前应用最广泛，可以满足从分析到半制备的分离3–3.5µm常用于分析柱上的快速分离，色谱柱短，节省溶剂<2µm常应用于超快速分离，highthroughput,分离度高7–10µm常用于半制备色谱柱10–20µm常用于制备色谱柱47硅胶粒径的影响粒径作用和效能5µm48HPLC色谱柱的构成类型内径D(cm)柱长(cm)粒径(µm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制备柱0.8–1.010-255-20制备柱2.0–5.010-255-2048HPLC色谱柱的构成类型内径D(cm)柱长49评价色谱柱好坏的标准1）理论塔板数N2）拖尾因子Tf3）色谱柱背压4)色谱柱批与批之间的重现性5）pH值的适用范围6）使用寿命49评价色谱柱好坏的标准1）理论塔板数N50理论塔板数N粒径(µm)柱长(cm)塔板数N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00031012,000-14,00031517,000-20,00050理论塔板数N粒径(µm)柱长(cm)塔板数N51拖尾因子TfAs=1.0-1.05很好As=1.2

一般As=2差As=4很差不对称因子和拖尾因子的关系As(at10%)Tf(at5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不对称因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高51拖尾因子TfAs=1.0-1.05As=1.252色谱柱背压粒径均一会使色谱柱的背压相对较低。色谱柱两端的压力降不应超过公式计算所得的30％。硅胶粒径对色谱柱的压力具有很大的影响；硅胶粒子越小，色谱柱的背压越大。色谱柱的背压还与流动相的粘度有关。P=3000Lηt0dp2P

是色谱柱背压(psi)，L

是色谱柱的长度(cm),η

流动相的粘度(cP)，t0

是色谱柱死时间,dp

是粒子的直径(µm)52色谱柱背压粒径均一会使色谱柱的背压相对较低。P53为什么色谱柱会失去分离能力?部分原因是色谱柱塞板或柱床被堵塞——导致色谱柱背压上升、峰形拖尾和柱效下降。吸附了样品杂质——导致柱效下降、选择性和保留时间改变。色谱柱没装填好——导致柱效下降和峰形拖尾。物理损伤或受热引起的缺口——导致柱效下降和峰形拖尾。对硅胶基质或键合相的化学腐蚀——导致选择性变弱、峰形拖尾、保留能力下降（或对碱性化合物的保留能力增强）。53为什么色谱柱会失去分离能力?部分原因是色谱柱塞板或柱床被54现代高效液相色谱柱的要求超纯B型球形硅胶——峰形好、柱效高。不能有使色谱性能降低的直径小于50Å的微孔。粒径尺寸从3µm到10µm——能满足从分析到制备色谱规模的需求。色谱柱柱床装填好——使用寿命长、柱效高。封尾彻底——峰形好、使用寿命长。批与批之间得重现性好。不同的相具有不同的选择性——能更好的实现分离。键合相化学稳定好——适用的pH范围广,使用寿命长。54现代高效液相色谱柱的要求超纯B型球形硅胶——峰形RPC是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的—种液相色谱分离模式。反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．反相色谱

reversedphasechromatography,RPCRPC是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流固定相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS–Octadecylsilica)。烷基化密度：45%，55%的羟基用 三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全 非极性化。溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，m高。流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇,乙晴,异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等)洗脱：[有机溶剂]增加。固定相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基30µm15µm5µmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect30µm15µm5µmInfluenceofParticSourceRPCSourceRPC应用：主要应用于5000KD以下，特别是1000以下的非极性小分子物质的分离蛋白质：可以应用，但存在变性的危险。[有机溶剂][有机溶剂]60为什么反相色谱应用如此广泛?它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。

所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。60为什么反相色谱应用如此广泛?它能使中性化合物和极性化合物六、HPLC法的应用采用峰面积法或峰高法(1)内标法(2)外标法

1定性分析2定量分析HPLC分离速度快、效率高、试样分析重现性好，而且试样不需气化，只需制成溶液，即可在室温下进样分析，所以此法应用范围极广，对挥发性差或遇热不稳定的成分及某些高分子化合物的分离极为有利。六、HPLC法的应用采用峰面积法或峰高法1定性分析HPL外标法——标准曲线法用待测组分的纯样制标准曲线优点：快速简单。只要待测组分出峰且完全分离即可缺点：绝对法,进样量,操作条件要不变

外标法——标准曲线法用待测组分的纯样制标准曲线外标法——外标一点法

当外标试样中各组分浓度变化范围不大时，可不必绘制标准曲线，而用单点校正法，即配制一个和被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，由被测组分和外标组分的峰面积或峰高比来定量WiWs=AiAs外标法——外标一点法当外标试样中各组分浓度变化范围内标法将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物和内标物的质量以及相应的峰面积比，求出含量mi=fi×Aims=fs×Asmims=fi×Aifs×As内标法将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根内标校正曲线法和内标对比法配制一系列不同浓度的对照液，并加入相同量的内标物，进样分析，测得Ai和As，以Ai/As对对照溶液浓度作图。（Ai/As）样=Ci样（Ai/As）标Ci标内标校正曲线法和内标对比法配制一系列不同浓度的对照液，并加入取咖啡因试样25.0mg，加入10.0mg非那西丁，溶于氯仿，定容25.00ml。进样得色谱图1，记录峰面积。取咖啡因标准品25.0mg，加入10.0mg非那西丁，溶于氯仿，定容25.00ml。进样得色谱图2，记录峰面积。用纯物质的氯仿溶液进样，以确定各组分的峰位。由色谱图2计算咖啡因相对于非那西丁的相对校正因子。由色谱图1按内标法求算咖啡因试样百分含量。咖啡因含量测定取咖啡因试样25.0mg，加入10.0mg非那西丁，溶于氯仿七、在生化药物分析中的应用氨基酸的分析：组成分析，含量。蛋白质、多肽的分析：序列分析，含量，纯度，肽图。糖类的分析：核酸的分析：其他:抗生素、维生素等七、在生化药物分析中的应用氨基酸的分析：组成分析，含量。重组人胰岛素【鉴别】（l）在效价测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

重组人胰岛素【鉴别】(2)取本品适量，用0.1%三氟醋酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20ul，加0.2rnol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液(pH7.3)20ul、0.1%V8酶溶液20ul与水140ul，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸3ul，作为供试品溶液，另取重组人胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液〔pH,2.3〕一乙腈(90:10)为流动相A，乙腈一水〔50:50〕为流动相B，进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各25ul，分别注人液相色谱仪。记录色谱图,供试品的肽图谱应与对照品的肽图谱一致(2)取本品适量，用0.1%三氟醋酸溶液制成每1ml中含10相关蛋白质取本品适量，0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含3.5mg的溶液，作为供试品溶液。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)一乙腈(82:18)为流动相A，乙腈一水(50：50)为流动相B，进行梯度洗脱。调节流动相比例使重组人胰岛素主峰的保留时间约为25分钟，系统适用性试验应符合效价测定项下的规定。取供试品溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，总相关蛋白质不得过3.0%。【检查】相关蛋白质【检查】高分子蛋白质取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法〔附录VH)试验。以色谱用亲水硅胶为填充剂(3~10urn};冰醋酸一乙腈一0.1%精氨酸溶液(15:20:65)为流动相，流速为每分钟0.5ml,检测波长为276nm。取重组人胰岛素单体一二聚体对照品用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含4mg的溶液;取100ul注人液相色谱仪，重组人胰岛素单体与二聚体的分离度应符合要求。取供试品溶液100ul，注人液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算，高分子蛋白质总量不得过1.0%。高分子蛋白质照高效液相色谱法(附录VD)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（5～10um）;0.2rnol/L硫酸盐缓冲液(取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7rnl、水800ml，用乙醇胺调节pH值至2.3,加水至1000ml-乙腈(74：26，或适宜比例)为流动相;柱温为40℃，检侧波长为214nm,取重组人胰岛素对照品，用0.0lmol/L盐酸溶液制成每1rnl中含lmg的溶液，室温放置至少24小时后，取20ul注人液相色谱仪，胰岛素峰与A21脱氨胰岛素峰的分离度不小于1.8，拖尾因子不大于1.8。