食品安全快速检测-复习资料

一、食品安全问题国内2008年奶粉三聚氰胺，2010年7月又重现江湖；2010年的海南“豇豆事件”及“农夫山泉事件”；2010年8月出现的“圣元奶粉早熟事件”国外2010年8月美国的鸡蛋沙门氏菌事件；2010年8月出现的超级细菌事件。2010年10月26日，中国疾病预防控制中心发布信息称，近期检测出三株NDM-1耐药基因阳性细菌。这三个病例分别来自于今年3月和6月提取的细菌样本，特别是两例新生儿病例，基本可以由此排除境外传入的可能。此次所测细菌的实际取样时间，早于英国科学家发现NDM-1之前。这也就表明，早在英国科学家发现超级细菌之前，超级病菌此前就在中国存在。“分别在宁夏和福建查出的含NDM-1耐药基因细菌病例，可以理解成该耐药基因可能已经存在于人群中，只是尚未被检测到。”10月27日，中国疾控中心办公室主任王健在接受本报记者采访时说。二、《食品安全快检技术》与《食品分析》的区别内容上；分析手段上；分析的目的。免疫标记技术（放射免疫、荧光免疫、胶体金免疫技术及酶联免疫技术）。PCR（polymerasechainreaction）技术。基因芯片技术。生物酶抑制技术等。三、主要内容（理论）第一章免疫技术重点为ELISA技术第二章基因食品的检测重点为PCR技术第三章食品中有害化学物质的检测重点为胆碱酯酶抑制法测定农药,微生物生长抑制法测定抗生素第四章食品中有害微生物的快速检测重点为微生物的显色培养快速检测法第五章食品中毒素的快速检测重点为生物法测定食品中的毒素第一章免疫学技术第一节有关免疫的基本理论一抗原与抗体的基本理论（一）抗原1抗原的定义完全抗原：进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞（免疫原性），并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质（免疫反应性）。半抗原：只具有免疫反应性。2免疫原性抗原能否成功诱导宿主产生免疫应答取决于三个方面：抗原异质性：抗原物质和宿主本身物质之间的差异，抗原物质的来源和宿主的亲缘关系越远，抗原性越强；分子量：越大，免疫原性越强；化学结构：蛋白质＞多糖和核酸；支链、环状结构＞直链，球形＞线形分子。宿主个体发育、生理状态和遗传性等都对免疫原性有很大影响，所以不同动物，同种动物的不同个体的免疫都有差异。免疫方式主要包括抗原的进入途径、剂量、次数、间隔时间等。3特异性体现在免疫原性及免疫反应性上。一种抗原只能诱发一种特异的免疫应答，结果形成特异性抗体或致敏淋巴细胞；抗原只能与其诱导的特异性抗体或致敏淋巴细胞进行反应，这是其在食品安全快检中得以广泛应用的基础。抗原的特异性是由抗原决定簇决定的，抗原决定簇是抗原分子上具有一定组成和结构的特殊化学基团，多数天然抗原分子通常存在多种抗原决定簇，一般来讲，不同的抗原其抗原决定簇不同，但有时，某一种抗原决定簇也会出现在其他抗原分子上，使其成为共同抗原决定簇，这种抗原决定簇是抗原抗体交叉反应的基础。4抗原分类根据来源分：天然、人工和合成抗原三类，天然抗原指天然的生物、细胞及天然产物；人工抗原指人工化学改造后的抗原，如半抗原经化学改造后就是人工抗原；合成抗原是指化学合成的抗原，比如氨基酸的聚合物。根据水溶性分：不溶的颗粒抗原和可溶性胶体抗原，如细菌的鞭毛、纤毛和菌体都是颗粒抗原；蛋白质、多糖、DNA和真菌毒素都是可溶性胶体抗原。按亲缘关系不同：自身抗原、同种型抗原、异种抗原。按免疫应答机理：普通抗原和超级抗原（极低浓度的抗原产生非常强的免疫效应）。（二）抗体1抗体的定义、分布和分类抗原刺激宿主免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）。主要存在于动物的血清中，也存在于体液和体外分泌液，如乳汁和细胞分泌液中。Ig包括很多种类，比如人类的Ig可分为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE五大类，其中IgG、IgA分别可进一步分成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA1、IgA2亚类。2抗体的结构以人的Ig为例，IgG、IgD、IgE以抗体单体形式存在，而IgM由五个抗体单体通过J链连接在一起的五聚体，因此IgG、IgD、IgE属二价抗体，而IgM为十价抗体。二抗原和抗体的制备（一）抗原的制备1细菌细胞抗原的制备通常将细菌于固体培养基上培养，挑取菌落入无菌生理盐水中，灭菌，离心，用无菌生理盐水配制成菌悬液，备用。2可溶性抗原制备与纯化蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、脂多糖、细菌外毒素等可溶性抗原中相当部分来源于组织细胞，成分比较复杂。通常需要将组织和细胞破碎，经一定的方法纯化后才能获得所需的抗原。（1）通过酶（溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等）消化细胞溶菌酶：主要通过水解肽聚糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，由此可见，更适合于G+；纤维素酶：也能水解β-1,4糖苷键；蜗牛酶：消化腺中发现有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸转移酶等多种具有生物活性的混合酶。（2）反复冻融、或者超声波破碎。（3）表面活性剂处理使细胞壁破坏。通过上述三种方法使细胞内容物溢出，通过离心除去细胞碎片即可。如果要制备单一成分的抗原，如蛋白质，还需经过离心、盐析、凝胶色谱、离子交换色谱等方法纯化。3半抗原免疫原的制备及检验属于半抗原的物质是低分子量的物质，如多糖、激素、抗生素、农药及其他化学物品等。这些小分子物质并不是免疫原，只有与合适载体连接后，才有免疫原性。常见的载体有多聚赖氨酸、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、牛血清蛋白(BAS)、卵清蛋白(OV)等。与载体连接方式：物理方法、化学方法物理法：通过载体（CMC、PVP）的电荷和微孔吸附半抗原。化学法：利用某些功能基团将其连接到蛋白质载体上。如果带有游离氨基或羧基以及2种基团都有的半抗原，可直接与载体连接，如果没有，需改造使其带有游离氨基或羧基才能与载体连接。半抗原与载体结合的数目与免疫原性密切相关，一般认为至少要有20个以上的半抗原分子联结到一个载体分子上，才能有效地刺激免疫动物产生抗体。常用吸收光谱法测定。4佐剂与抗原混合，能非特异性地增强抗体应答的物质。目前人和动物用的免疫佐剂主要是金属盐类（氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙等）、乳化的水-油佐剂（也称弗氏佐剂，由液体石蜡与无水羊毛脂加热混溶而成，称不完全弗氏佐剂，再加入死分枝杆菌如卡介苗以增强炎性反应，称完全弗氏佐剂，这类佐剂副反应严重，主要用于动物制备抗体）（二）抗体的制备1多克隆抗体的制备多克隆抗体是抗原或抗原与佐剂的混合物按一定程序直接免疫试验动物后获得的抗血清。不同的抗原决定簇刺激不同的B淋巴细胞（抗体产生细胞）克隆产生的抗体混合物，所以称多克隆抗体。（1）动物选择食品安全中检测有害物质和微生物常用的动物为鼠（大鼠、小鼠、豚鼠）和兔子。（2）免疫步骤注射：通常的方案是少量多次。动物产生有效抗体的过程有一定时间规律，一般在首次接触抗原的7-10天后，动物血清中才有抗体出现，并在14-21天内达到高峰值，这段时期称初次反应，此后一定时间内，如再次接触同一抗原，则特异抗体的生成量将会超过初次反应的许多倍，称二次反应。抗体效价测定：效价在1：16以上，能达到1：64，即可达到要求，应及时采血，否则抗体将会下降。（常用免疫双向扩散法测定）免疫双向扩散法测定效价：溶化琼脂糖放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，冷却凝固，打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生。（3）采血及抗体效价测定采血方式：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血方式。抗体收集：抗体存在血清部分，血液室温凝固1h，4℃过夜，血块收缩，将血块离心得残存于其内的血清，收集两部分血清，离心，存贮于-20℃或-70℃。（4）抗体的纯化及鉴定抗体与所有蛋白质一样，具有一定的溶解度、荷电性、分子大小、疏水程度和配体专一性，因而能够利用盐析沉淀、层析和电泳等技术将抗体分离纯化。抗体纯化要先清楚抗体的用途，用于酶标检测时，只需除去干扰实验的杂质即可。常用的方法有盐析、盐析+凝胶过滤、离子交换+凝胶过滤、阳离子交换+阴离子交换+凝胶过滤、盐析+亲和层析、亲和层析+阴离子交换+凝胶过滤等。鉴定：可以用凯氏定氮法测定其含量、或者分光光度法测定蛋白质含量，也可用凝胶电泳检测其纯度。（5）抗体的保存纯化后的抗体保存十分重要，保存不当，可导致抗体效价下降或消失。常用的方法有：液体保存：抗体经过滤除菌后，加入0.1%的NaN3或硫柳汞以防腐，存于4℃可保存半年到一年；低温保存：抗体分成小包装，于-20℃--40℃保存，一般1年效价不会有明显下降，但应防止反复冻融；冷冻干燥保存：冻干后置于普通冰箱4-5年效价无明显下降。2单克隆抗体的制备单克隆抗体是由单一的B淋巴细胞克隆、针对单一的抗原决定簇产生的均一的免疫球蛋白。因为单克隆抗体的制备是以细胞（包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞和融合子等）为实验对象，在制备过程中采用了细胞融合、细胞培养和细胞克隆等细胞工程技术，因此单克隆抗体又称为细胞工程抗体。3单抗与多抗的主要特点比较

单抗多抗种属来源小鼠兔子、羊、豚鼠等混合物×√纯化、标记易难特异性强差制备周期长（最短4个月）短（2个月）制备技术复杂简单经费多少三抗原或抗体的固定化ELISA方法中，常将抗原、抗体通过物理或化学方法，与不溶水的固相载体相结合，使以后的免疫反应都与固相载体发生联系，便于分离结合和游离的免疫反应物，将蛋白质物质与固相载体连接的过程，称蛋白质的固相化或包被技术。可用作固相载体的材料主要两类：一类是天然有机物，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、淀粉及他们的衍生物；一类为人工合成的高分子聚合物，如聚苯乙烯、聚氯乙烯等。固定化的既可通过物理吸附方式，也可通过化学偶联方式。第二节免疫学检测技术一免疫沉淀及免疫凝集反应（一）免疫沉淀（单向免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、对流免疫电泳等）根据抗原、抗体在适量电解质存在条件下发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物并出现肉眼可见的沉淀或浑浊，在固体载体中表现为沉淀线，液体中出现絮状物或液体浑浊。由于其灵敏度较低，通常作定性分析，食品安全检测中主要作为病原菌的定性测定和鉴定。（二）免疫凝集颗粒抗原（细菌、血红细胞等）或可溶性抗原结合于不溶性的载体微粒上后与相应的抗体在适当条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝聚物。1直接凝集反应：颗粒抗原+抗体；2反相被动凝集反应：可溶性抗体-不溶性颗粒+抗原；3间接凝集反应：可溶性抗原-不溶性颗粒+抗体。间接凝集反应中的不溶性颗粒如血红细胞、金黄色葡萄球菌的菌体、乳胶、胶体金、磁珠和明胶颗粒等。血红细胞来自于人或别的动物的血液，采血后加入抗凝血剂，然后离心即可获得血红细胞，对于多糖抗原，可以直接吸附，对于蛋白质抗原或抗体须以戊二醛作为交联剂连接。金黄色葡萄球菌的菌体上有一种表面蛋白质，能非特异性地结合在IgG的Fc片段上，而不影响抗体于抗原的结合。乳胶是聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯的微粒溶液，可以直接吸附抗原或抗体，也可引入-COOH后，将抗原或抗体包被。（三）免疫沉淀及凝集灵敏度免疫学方法灵敏度/L沉淀反应单相免疫扩散试验双相免疫扩散试验火箭免疫电泳对流免疫电泳＜10-20mg＜10mg＜5mg＜1mg凝集反应凝集反应被动血凝实验＜10μg＜10μg二标记免疫学技术根据标记物不同，标记免疫学技术可分为：酶标记、放射性标记、荧光标记等三种。荧光标记免疫分析是1941年Coons首先建立，放射标记免疫分析是1956年Yelow和Berson提出，而酶标记免疫分析技术是受前面两种标记免疫分析技术的启发而建立的。标记免疫学技术的与其他免疫学技术相比，最大的特点是灵敏度大大提高。（一）标记免疫的灵敏度及特点免疫学方法灵敏度/L沉淀反应单相免疫扩散试验双相免疫扩散试验火箭免疫电泳对流免疫电泳＜10-20mg＜10mg＜5mg＜1mg凝集反应凝集反应被动血凝实验＜10μg＜10μg标记免疫技术放射标志免疫分析酶标志免疫分析定量荧光标志免疫分析＜10pg荧光标记免疫分析存在着需要昂贵的荧光显微镜、染色标本不能长期保存和难以定量等缺点；放射标记免疫分析存在需要特殊的仪器，标记物因放射同位素的衰变而不稳定，且对人体有害；酶标记免疫分析则不存在这些缺点，甚至凭肉眼也可判读结果，因此被越来越多、越来越广泛地使用。这里主要介绍酶标记免疫技术。（二）酶标记免疫技术1971年：Engvall和Perlmann采用碱性磷酸酶为标记，定量检测了家兔血液中的IgG。同年：van-Weemen和Schuurs也报道了他们关于EIA研究的开拓性研究，他们成功地对人体尿液中的HCG（humanchorionicgonadotrophin，人绒毛膜促性腺激素）进行了定量检测。使用辣根过氧化物酶作为标记酶。1976年：荷兰OrganonTeknika的研究小组运用EIA法检测乙型肝炎表面抗原获得成功，并推出了市售的以96孔模板为特征的乙型肝炎表面抗原检测系统。这是第一个取得了商业运作的EIA技术。随后，对于微生物和病毒的诊断试验如风疹抗体，弓行虫抗体相继开展，1980年，开始使用EIA法检测人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体。1原理以96孔、48孔或40孔的聚苯乙烯塑料微孔板（酶标板）为载体，抗原或抗体吸附在微孔的内壁上成为固相抗原或抗体，游离的则通过洗涤除去，然后加入酶标抗体或抗原（或先加入适当抗体或抗原）形成的酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，加入酶底物，一定条件下，复合物上酶的量（抗原或抗体的量）和酶产物呈现的色泽成正比，可用分光光度计测定。（聚苯乙烯能吸附蛋白质）2分类直接法、间接法和夹心法。

固相复合物直接法抗原（抗体）抗原（抗体）-抗体（抗原）-酶间接法抗原抗原-一抗-二抗-酶夹心法抗体抗体-抗原-一抗-酶抗体-抗原-一抗-二抗-酶上述每种方法中又分为竞争法和非竞争法。所谓竞争是指抗体抗原结合过程竞争中有竞争现象存在。3EIA常用的酶、底物及标记方法酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶(常用)(HRP,horseradishperoxidase）邻苯二胺(常用)橘红色4925-氨基水杨酸(常用)棕色449四甲替联苯胺黄色460邻联苯甲胺兰色425碱性磷酸酯酶(常用)(AP,alkalinephosphatase）4-硝基酚磷酸盐(PNP)黄色400萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500葡萄糖氧化酶（GO,glucoseoxidase）ABTS+HRP+葡萄糖黄色405葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色420β-Ｄ－半乳糖苷酶(BG,β-Ｄ-galactosidase)甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)荧光360,450硝基酚半乳糖苷(ONPG)黄色420将酶通过具有双功能基团的交联剂结合到抗原或抗体分子上，或将酶分子氧化产生活性基团，再与抗原或抗体分子结合的过程。常用的交联剂有戊二醛、过碘酸钠等。过碘酸首先氧化酶的糖基，通过生成的醛基同抗原或抗体的蛋白质的氨基起反应。因此过碘酸钠的交联作用限于糖蛋白，如过氧化物酶。戊二醛带有活性醛基，可直接和蛋白质的氨基相结合。但往往造成蛋白质的自身交联，常用于碱性磷酸酶的标记。4ELISA操作过程以间接竞争ELISA测定黄曲霉毒素B1（AFB1）为例。①抗原包被（antigencoating）包被的抗原浓度过高，易产生空间位阻，阻碍抗体抗原结合，抗原浓度过低，可供抗体结合的抗原过少都不利于测定。②封阻（blocking）在微孔内加入一定浓度BSA、OV、明胶或脱脂牛奶等溶液以封阻微孔内没有包被的空隙，避免抗体非特异性地吸附这些空隙，以提高实验结果的准确性及可靠度。③抗原抗体竞争反应酶标板微孔中加入一定量的抗体（抗血清），同时分别加入一定量的不同稀释倍数的AFB1标准溶液，或待测样品的抽提液，混匀，37℃保温保湿1-2h，再经洗涤，游离的抗原抗体复合物被洗涤除去。④酶标二抗与抗原抗体复合物的反应将一定量的酶标二抗加入反应孔，37℃保温保湿1-2h，再经洗涤，游离的酶标二抗被洗涤除去。⑤底物显色反应和吸光值的测定每孔加入反应底物（邻苯二胺、双氧水溶液），37℃保温保湿，避光反应30min，每孔加入2mol/L硫酸溶液终止反应，5min后，以酶联免疫测定仪于490nm测吸光值。⑥ELISA竞争抑制曲线以标准AFB1的浓度对数为横坐标，以相应的竞争抑制率（不同浓度的AFB1吸光度/AFB1为零的吸光度）为纵坐标，可以得到直线回归方程。5ELISA的进展（1）亲和素：卵清蛋白中提取的碱性糖蛋白，对生物素（维生素H，属于B族维生素）有很高的亲和力，1个亲和素可以结合4个生物素，而生物素容易结合抗体或酶等蛋白质，1个抗体或酶可以结合多个生物素分子。亲和素-生物素系统（avidinbiotinsystem）增加了信号强度，实现了放大作用，从而提高了ELISA的灵敏度。（2）荧光酶免疫分析：因将荧光底物代替普通底物，通过底物在酶的催化作用下产生的荧光强度来测定抗原抗体反应，提高ELISA的灵敏度，因为比色测定的极限约为10-3μg/mL，光密度也限定在0.001-2.0之间，这些都限制了ELISA的灵敏度，而荧光的测定极限可以达到10-6μg/mL，目前ELISA中常用的HRP、AP和BG都有相应的荧光底物。三其他免疫学方法（一）金免疫技术金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。通常的载体为硝酸纤维素膜。胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol），是由金盐（主要是氯金酸（HAuC14））被还原（柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等作为还原剂）成金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12-），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金与蛋白质结合一般认为是物理吸附性。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。GB/T19495.8-2004蛋白质检测方法在阳性样品中，由于抗原与金标记的抗体形成的复合物在迁移至抗体时（T带），被截留，于是红色金颗粒被富集，形成红色条带，而阴性样品中没有抗原存在，尽管红色金标记的抗体也在迁移，但在T带时并不能被截留，所以不出现红色条带。（二）均相酶免疫测定法（homogeneousenzymeimmunoassay,HEI）Rubenstein等在20世纪70年代初创建的技术。主要特点：无需分离游离的和结并的酶标记物，因而不需要载体。抗原与酶标记物结合后，可使酶的活性受到抑制或激活，但当再与相应抗体结合后，其酶活性被激活或抑制。整个操作过程中，无需将游离的和已形成的抗原-抗体-酶复合物加以分离。均相酶免疫测定主要用于检测小分子半抗原，如激素和药物成分等。可用于此类检测方法的酶类主要有葡萄糖—6—磷酸脱氢酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。此法的检测敏感性低于ELISA法，但操作简便、快速，准确性和重复件好，所需仪器少，为很多自动化测定系统所采用。第二章转基因食品的检测第一节概述1、转基因生物与转基因食品的定义转基因生物（GMO,geneticallymodifiedorganism）：根据国务院发布的《农业转基因生物安全管理条例》的规定，利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物及微生物。基因工程指利用载体系统的重组DAN技术以及利用物理、化学和生物等方法把重组DNA导入到有机体的技术，而传统的杂交育种、细胞融合、化学和物理诱变等技术不被当作基因工程技术。转基因食品就是含有转基因生物成分或者利用转基因生物生产加工的食品。目前主要的转基因食品主要来源于转基因植物。2、转基因生物和转基因食品的发展历史与现状1983年首次报道了转基因烟草和马铃薯；1994年首批转基因植物获得批准进行商品化生产，如延熟西红柿和抗除草剂棉花等；2001年，问世的转基因动物有猪、羊、鱼、奶牛等，转基因酵母和酶等；转基因产品的发展与进出口贸易：转基因作物自1996年的170万公顷增加至2008年的12500万公顷，1999-2003年，美国、阿根廷、加拿大、中国种植了全球99%的转基因作物，以2001年为例，中国占约3%，美国约占68%。转基因的作物主要是大豆、玉米、棉花及油菜。转基因抗除草剂作物面积居第一，其次是抗虫玉米。转基因产品通过贸易进入国际市场，美国、加拿大、阿根廷为主要的出口国，发展中国家是主要的进口国。二、转基因食品的安全性问题1、转基因食品对人体健康可能产生的影响（1）携带的抗生素基因可能使人与动物的肠道病原微生物产生耐药性。（2）抗虫农作物体内的蛋白酶抑制剂和抗虫毒素，可能对人体健康有害。所以奥地利、卢森堡禁止转基因抗虫玉米进口。（3）抗除草剂农作物的推广，可能导致除草剂用量增加，从而导致除草剂在食品中残留量加大。（4）转基因作物中病毒基因有可能浸染该植物的其他病毒进行重组，产生新病毒或超级病毒。（5）转基因食品进入人体，可能使人出现某些毒理作用和过敏反应，国外已有报道儿童引用转基因大豆豆浆产生过敏反应的报道。2、对生态可能的影响（1）转基因作物本身可能转变成杂草，作物的高产基因通过花粉导入方式给周围杂草，会引发超级杂草出现，对天然森林造成基因污染。（2）美国DPL公司和美国农业部联合申请了一个“终止子技术”的专利，并于1998年获得通过，该技术使作物得到的后代种子不育，许多国家认为，由于外观上无法分清这种种子，如果被出售，播种后可能造成生产的不可弥补损失，通过花粉传播其中的不育基因，导致当地农业崩溃。（3）抗虫、抗病、抗除草剂类转基因作物，除对害虫产生影响外，对环境中许多有益生物也产生直接或间接的影响。（4）用于食品的植物通过基因改良成药用植物，通过花粉会使食用的植物产生药性，污染人类的食品供应。3、各国的态度美国在生物技术的开发及应用走在世界前列，称转基因食品与传统食品一样，是安全的，对人体无害；欧盟等国家认为转基因食品应用于生产和消费的时间尚短，对人类健康及环境的影响尚需长期考察，比如DDT，研制初期经过安全性测试，但经过几十年才发现其残留的危害,。欧盟也有6个国家允许种植转基因作物。认识到转基因生物潜在风险后，有关国际组织和政府已制定和完善其生物安全法规：（1）联合国环境规划署（UNEP，UnitedNationsEnvironmentProgramme）和生物多样性公约（CBD，TheConventiononBiologicalDiversity）秘书处从1994年开始制订《生物安全协议书》，2000年联合国通过了该协议书，规定了进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做了详细规定。（2）欧盟委员会（EuropeanCommission）的欧洲食品独立权力机构规定：欧盟15国的食品公司和出口至欧洲的外国公司将含有1%以上的转基因成分的食品贴标，对转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程“跟踪”。（3）美国要求对非转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程“跟踪”检测，确保非转基因产品不被转基因产品污染。（4）其他许多国家如澳大利亚、新西兰、韩国、日本等国都对基因食品必须标识上作了相应规定。（5）中国国务院于2001年公布并实施了《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年公布了《农业转基因生物安全评价》、《农业转基因生物进口安全管理办法》、《农业转基因生物标识管理办法》，2006年公布了《农业转基因生物加工审批办法》；中国国家质检总局于2001年公布并实施了《进出境转基因产品检验检疫管理办法》。于2009年8月17日依法批准发放了转植酸酶基因玉米“BVLA430101”、转基因抗虫水稻“华恢1号”及杂交种“Bt汕优63”的生产应用安全证书。2009年年底，转基因抗虫水稻和转基因植酸酶玉米获得农业部颁发的安全证书。这是中国首次为转基因水稻颁发安全证书。第二节我国转基因食品的检测概述一、检测机构国家农业转基因生物安全评价与检定中心，2009年10月开工建设、计划2011年12月投入使用。具有转基因产品定性检测资格的实验室25家，基本是检验检疫局下的实验室，其中广东（广州1、汕头1、深圳1、珠海2），海南没有。二、检测方法的标准1、2003年12个商检行业标准标准名称标准编号基因检验实验室技术要求SN/T1193-2003（商检标准）植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法SN/T1194-2003大豆中转基因成分的定性PCR检测方法SN/T1195-2003玉米中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1196-2003油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1197-2003马铃薯中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1198-2003棉花中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1199-2003烟草转基因成分定性PCR检测方法SN/T1200-2003植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1201-2003食品中转基因植物成分定性PCR检测方法SN/T1202-2003食用油脂中转基因植物成分定性PCR检测方法SN/T1203-2003植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法SN/T1204-20032、2003年农业部4个行业标准标准名称标准编号转基因植物及其产品检测通用要求NY/T672-2003转基因植物及其产品检测抽样NY/T673-2003转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化NY/T674-2003转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法NY/T675-20033、2004年8个国家标准标准名称标准编号转基因植物及其产品检测通用要求和定义GB/T19495.1-2004实验室技术要求GB/T19495.2-2004核酸提取和纯化方法GB/T19495.3-2004核酸定性PCR检测方法GB/T19495.4-2004核酸定量PCR检测方法GB/T19495.5-2004基因芯片检测方法GB/T19495.6-2004抽样和制样方法GB/T19495.7-2004蛋白质检测方法GB/T19495.8-2004第三节DNA提取一、DNA提取与纯化1、样品的研磨和粉碎（1）除杂蛋白质用酶或有机溶剂去除；多糖用合适的酶（果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶等）处理去除或有机溶剂去除；脂类用酶或正己烷去除；RNA，用RNase去除；盐类去除。（2）纯化沉淀法：乙醇和异丙醇沉淀浓缩DNA；固体介质吸附法：阴离子交换树脂、二氧化硅、玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。（3）主要方法A、苯酚—氯仿法在高浓度SDS和EDTA的溶液中热裂解细胞，酚/氯仿去除杂质（脂类、多糖、蛋白质及核酸酶），最终用乙醇沉淀DNA并除去盐及残留的氯仿，关键步骤为裂解。该法适用范围广，当分析富含多元醇、叶片或者绿色物质时，很多PCR抑制剂会和DNA共沉淀，会使PCR扩增困难。B、PVP法（polyvinylpyrrolidone,聚乙烯吡咯烷酮）在高浓度SDS和EDTA的溶液中热裂解细胞，裂解出的成分（多酚、多糖、新陈代谢成分、蛋白质）和PVP和乙酸铵结合除去，用乙醇沉淀DNA并除去盐。该法适用范围广，尤其适合富含多酚成分的样品。C、CTAB（hexadecyl-trimethyl-ammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵）法该法由CTAB热裂解、抽提（去除多糖及蛋白质）、异丙醇沉淀核酸及乙醇洗涤核酸等步骤组成。在裂解液中加入淀粉酶处理含有淀粉类的样品，加入蛋白酶K除去蛋白质，加入RNase去除RNA等。DNA提取时，盐浓度低于0.5mol/l或室温低于16℃该法适用于提取植物及植物类产品中的DNA，有效去除多糖及多酚。D、硅藻土法SDS热裂解，盐酸胍存在下，核酸结合硅藻土，异丙醇洗涤，杂质脱离，最后用低盐溶液将硅藻土上的DNA洗脱下来。本法需要三氯甲烷并且要求的离心速度低，可大规模提取并易于自动化。该法适用范围广，也可用于其他方法提取DNA后的纯化，不适合脂类丰富的材料。E、试剂盒法日常检验中一般采用DNA提取试剂盒来提取样品DNA，也是上述几种方法的结合，常用的试剂盒有Promega公司生产的磁珠试剂盒，Qiagen公司生产的柱式离心管试剂盒，Takara公司生产的GMODNA提取试剂盒，对于深度加工食品，DNA严重降解，含量低，Promega公司生产的磁珠试剂盒效果较好。二、提取DNA的定量1、紫外光谱法（1）原理溶液中的核酸可以吸收210-550nm的紫外线，在260nm达最高峰。当OD260=1时：双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA浓度为38μg/ml；单链RNA浓度为40μg/ml。所以被测对象的OD×50或38或40。（2）说明注意比色杯用石英比色杯；该法也可测定核酸的纯度。本法定量范围为2-50μg/ml，OD值应该在0.05-1之间，但CTAB法中，如果CTAB残留，则干扰测定，因为CTAB在260nm处有吸收.2、琼脂糖电泳法（1）原理当DNA分子处于分子筛中（比如琼脂糖），在缓冲液存在情况下，处于电场中，根据DNA本身所携带的电荷和分子量，被电泳分离。EB（溴化乙锭）可以镶嵌到DNA分子中，当受紫外线激发时，散发橘黄色的荧光，但EB也可镶嵌至单链DNA和RNA分子中，因此需要酶去除RNA。由于荧光的亮度与DNA量成正比，根据荧光强度，与已知含量的不同浓度的标准DNA进行对比可知DNA溶液的浓度。但应注意，标准DNA的分子量应该和待测DNA的分子量相近，因为荧光的散发和DNA片段的长度相关。（2）说明本法定量范围为5-500ng/ml(1μg=1000ng)，该法为DNA浓度定量常规方法，尤其是DNA浓度不足以光谱定量时，或纯度不高，或混有某些吸收紫外线的杂质时；可以分析如DNA降解程度、RNA残留的存在和一些污染物，但如果有降解，则不宜使用该法定量。第四节转基因食品的检测一、PCR定性法1、PCR技术简史分子克隆、DNA测序及PCR是分子生物学的三大主流技术。PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好及易自动化等突出优点；可从一根毛发、一滴血，甚至一个细胞扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天、几周的事情，现几个小时便能完成。1971年，H.GhobindKhorana及同事年提出体外扩增的设想（技术条件限制）；1985年，KaryMullis及同事用大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段体外扩增哺乳动物基因（该酶不耐高温，每次循环都要重新添加，引物延伸反应在37℃进行，易发生模板与引物之间碱基错配，导致合成的产物特异性差，DNA片段不均一）；为此KaryMullis获得1993年诺贝尔化学奖。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（扩增的DNA片段均一，但仍需加新酶）；1988年，Saiki等从温泉中分离到嗜热杆菌，其中含耐热DNA聚合酶—TaqDNA聚合酶。（Taq:thermusaquatics，嗜热水生）。2、PCR技术基本原理最终扩增量：Y=X(1+E)n，其中Y为扩增后DNA的拷贝数；X为起始DNA的拷贝数；E为扩增效率；n为循环次数。初期，DNA增加的拷贝数呈指数形式增长，通常20-30个循环后进入线性增长或静止。长短不一称为长产物片段，长短一致的称短产物片段，显然长产物片段呈算术倍数增加，几乎可以忽略不计，而短产物片段呈指数倍数增加，因此PCR扩增产物不需纯化，可以用于分析与检测。SHAPE3、PCR技术的反应体系扩增的模板（template）、一对寡核苷酸引物、维持pH的反应缓冲系统、一价或二价阳离子、4种dNTPs、耐热DNA聚合酶及PCR促进剂等。（1）模板DNA或RNA，如RNA，则需反转录生成cDNA(complementary)。模板既可单链也可双链，既可线性也可环状，但环状复性太快，影响引物与模板的结合，故常将环状用酶切开呈线性。（2）引物的设计原则引物长度：引物越长，特异性越好，但过长会使链延伸温度超过DNA聚合酶的最适温度，故一般为15-30bp（basepair)，常用为20。引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可增长至10kb的片段。引物成分：ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶呈串排列，G+C含量以40%-60%为宜，太少扩增效果不佳，过多易出现非特异条带；不应有连续的3个G或C，尤其是引物的3’端，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补而影响PCR的特异性。另外2条引物应有相似的Tm值，差别不应大于5℃。扩增产物与引物间的Tm值差别应小于10℃，确保PCR循环中的扩增产物有效变性。（注解Tm：通常将加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或溶解温度）引物浓度：一般为0.1-0.5μmol，过低则产物量低，过高会引起错配和非特异性扩增。由于引物设计较为复杂，现有引物设计的计算机软件，如“PermierPrimer”、“Oligo”、“Primer3”、“WebPrimer”、“DNAclub”等有指导作用。（3）耐热DNA聚合酶（ThermostableDNApolymerase）能耐受95℃以上的高温而不失活，因此无需在每轮循环中添加新酶，最适温度为70-80℃，应用最多的Taqpol。（4）dNTPs4种dNTPs的浓度要相等，反应浓度为200μmol/l左右，浓度过低会降低PCR产物的产量，浓度过高会导致错配。为防止PCR产物污染，可用dUTP代替dTTP，UNG酶(尿嘧啶DNA-糖基化酶，uracilN-glycosylase)能裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，特异性地去除dUTP切断DNA链，在PCR反应体系中加入dUTP和UNG酶，在PCR反应预变性前设置50℃，2min，UNG酶起作用，切断嵌合dUTP的PCR产物链，95（5）二价阳离子—Mg所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要该离子。（6）反应缓冲体系Tris-HCl(Tris：三羟甲基氨基甲烷)：保证反应过程中pH稳定；此外还有聚合酶的保护剂，如小牛血清蛋白、明胶、Tween-20或二硫苏糖醇（DTT：Dithiothreitol）4、PCR反应温度和循环参数通常操作条件：90-95℃，1-2min；50-60℃，20S-1min；70-75℃，40S-2min，对于扩增较短（80-150bp）的PCR反应，退火与延伸合二为一，60-65℃。（1）变性温度及时间只有当模板DNA和PCR反应产物完全变性成单链后，引物才能在退火过程中与模板结合。变性通过加热实现，加热温度取决于双链中G+C的含量，高则变性温度高，时间与DNA分子的长度相关，越长，时间就越长。（2）退火温度和时间引物长度越短、G+C含量越低，所需退火温度就越低。通常讲，退火温度降低可提高扩增产量，但错配现象增加，提高退火温度，提高了反应的特异性，但扩增率下降，退火温度确定后，时间不是关键因素，但应加以控制。引物退火温度通常=Tm值-5℃左右。（3）延伸温度及时间一般延伸温度在DNA聚合酶的最适温度附近，延伸时间视待扩增DNA片段长度而异，通常延伸1min，对于2kb的扩增片段足够。（4）循环次数其他参数都已优化的前提下，循环次数取决于最初靶分子的浓度，次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，通常为30-40个循环。5、定性PCR检测（1）内源参照基因的检测转基因作物中转入了外源基因，针对转入的外源基因设计特异性的检测引物，可以判断样品中是否含有外源基因，为了避免检测结果出现假阴性，在检测外源基因的同时，应同时检测作物的内源参照基因。只有在内源参照基因出现扩增的情况下，才能对外源基因的扩增结果作出正确的判断。食品和饲料加工原料的组分选择需检测的内源基因大豆Lectin玉米ZSSⅡb，ZEIN,adh1,IVR,HMG油菜PEP马铃薯Patatin番茄PG尚未发现特异性内源基因的植物trnl原料组分不明的食品和饲料18SrRNA（2）转基因产品的筛选检测、目的基因检测和品系检测目前已批准商业化种植的转基因作物除含有目的基因外，95%以上的转基因作物还含有CaMV35S启动子、Nos终止子或抗性筛选基因NPTⅡ基因。因此如果检测出有这些外源基因的存在就可定性检测食品中含有转基因的作物，含有某种转基因的作物。主要是通过凝胶电泳来验证待测基因片段的大小，比如大豆中的Lectin基因大小为118bp。或者限制性内切酶酶切后，凝胶电泳来验证酶切基因片段的大小，或者对扩增产物进行测序来进行确证。二、PCR定量法1、实时荧光PCR法（real-timePCR）1996年由美国AppliedBiosystems推出的一种新PCR技术。每个循环会有荧光释放，通常将前3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍作为荧光阈值，如果经过若干循环后，荧光超过这个信号，此时的循环数就是样本的Ct（cyclethreshold），而每个模板的Ct值与起始拷贝数的对数存在线性关系。故可用已知起始拷贝数的标准品作标准曲线，测定未知品的Ct值，便可在标准曲线上计算样品的起始拷贝数。（1）原理外源基因的引物，两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA，并实时检测PCR产物，与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质，以获得稳定的标准曲线，根据外源基因和内源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度），并有绝对含量计算转基因作物在测试样品中的相对含量。转基因产品的含量（%）=测试样品中外源基因的拷贝数/测试样品中内源基因的拷贝数×100（2）说明该方法也可以用于转基因食品的定性检测，比如SN/T1204-2003植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法中：阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值=40。空白对照：外源基因Ct值≥40，内参照基因Ct值≥40；阴性对照：外源基因Ct值≥40，内参照基因Ct值在20-30间；阳性对照：外源基因Ct值≤34。三、基因芯片法定性DNA芯片(DNAchip)技术是信息时代的产物，是1998年度世界十大科技进展之一。它是多学科交叉融合而形成的一项高新技术，横跨生命科学、物理学、计算机科学、微电子学、化学、材料科学等多个学科。在基因表达谱、功能基因组、疾病基因诊断等基础研究及临床应用中具有重大的基础研究价值，以及广泛的应用前景。DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核首酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面作为固相探针，待测的核酸片段人工标记上不同的荧光色素或放射性核素、生物素等作为靶片段，一定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号，进行计算机分析，从而得到靶片段的基因序列和表达情况等信息。1、基因芯片的制备与质控（1）基本概念基因芯片探针(DNAmicroarrayprobe)：固定于基质表面、能与样本DNA互补、用于探测样本DNA信息的已知序列核酸分子。基片（substrate）：基因芯片中用于固定探针的基质，如硝酸纤维素膜、尼龙膜、载玻片等，进过化学修饰制备而成。定位探针（positivepositionprobe）：一段与待测基因无关的寡核苷酸，通过和标记的定位探针互补链杂交显示信号，用于点样矩阵的位置的确定。阳性质控探针(positivequalitycontrolprobe)：用于样品抽提、PCR、杂交的反应体系的监控，一般用生物的管家基因来设计阳性质控探针。阴性质控探针（negativequalitycontrolprobe）：是一段与待测基因无关寡核苷酸，用于基因芯片非特异性杂交背景的监控。基因芯片空白质控点（noprobemicroarrayspot）：由不含核酸的点样液点制而成，用于基因芯片杂交背景的监控。目标基因探针(probefortargetgene)：用于检测目标基因序列的探针。信噪比（signalnoiseration）：是杂交信号值与杂交背景值的比值，由图像分析软件自动判读。（2）基因芯片的制备基因芯片的制备可以购买已有的成品，也可自己制备。比如美国Affymetrix公司的专利原位光刻合成技术生产的产品。A、基片制备用于基片的材料主要两类：实性材料（硅片、玻片、瓷片）、膜性材料（聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜）。对于实性材料而言，要使其衍生出羟基、氨基等活性基团（如异硫氰基法、戊二醛法），以便和活化的核苷酸发生化学反应而结合；对于膜性材料而言，通常要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸，使表面带正电荷以吸附带负电荷的DNA探针。B、探针制备可以制备也可购买产品。C、点样点样点包括定为探针、阳性质控探针、阴性质控探针、芯片空白质控点及目标基因探针，每种点样5次。D、点样后处理点样后芯片在80%RH环境下水合，然后在紫外交联仪上交联，双蒸水洗涤去除游离探针、晾干、用琥珀酸酐溶液或硼氢化钠溶液封闭无样品点区域的活性基团，再次双蒸水洗涤并晾干。（3）基因芯片的质控基片质控：用定位探针对基片点样，并进行点样后处理，再用其Cy5标记的互补链与其杂交，洗涤后扫描进行数据分析，如信噪比大于5.0为合格，同时观察点的成型是否圆整，点大小是否均一。基因芯片的质控：采用阳性标准物质杂交法，将扩增的PCR产物（注意此时已经被标记上荧光物质Cy5），经变性后，转移至芯片点样区域，进行杂交，杂交结束后，取出芯片，洗脱没能杂交的核酸，用扫描仪分析杂交结果，目标基因探针杂交信噪比均值大于5.0，阴性质控探针和基因芯片空白质控点杂交信噪比均值小于3.5判定合格。2、待检基因的PCR扩增及标记待检基因的PCR扩增同前面所提及的PCR扩增原理一样，只是在这里，必须对待检基因进行标记。标记物通常为Cy5(Anthocyanidin，一种花青素染料)。另外探针的标记也如同前面免疫标记一样，可用放射性标记、非放射性标记（半抗原标记如生物素和地高辛、荧光素标记、化学反光物质标记、光密度或电子密度标记如金、银等）。3、所需的仪器设备基因芯片点样仪、紫外交联仪、基因扩增仪、基因芯片扫描仪（具有分析信噪比的软件）、杂交仪、清洗槽、暗室。4、基因芯片法定性的原理将探针DNA有序地固定于玻片或其他固相载体上，测试样品的核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的探针按碱基配对原理同时进行杂交，洗去未互补结合的片段。然后通过激光共聚焦荧光系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，用计算机软件进行数据的比较和分析，从而获取样品分子的数量和序列信息四、蛋白质检测方法——ELISAELISA检测蛋白质具有灵敏性较高、特异性强、能定量检测等优点。ELISA检测转基因成分主要是检测转入的外源结构基因表达的蛋白，如抗甘草膦大豆及油菜中EPSPS编码的5-莽草酸-3-磷酸合成酶，抗虫玉米中Cry1Ab基因表达的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白及抗虫玉米Cry9C表达的杀虫蛋白。由于ELISA只能检测外源目的蛋白和一些选择标记基因表达的蛋白，检测覆盖率低，而且由于蛋白质易变性，ELISA法不能检测高温加工或深加工产品中转基因成分。3、应用实例（1）转基因植物及其产品中CP4EPSPS蛋白的ELISA检测A、背景知识草甘膦（Gyphosate）是一种施于叶片的、广谱性的、非选择性的有机磷类除草剂，其作用机理是特异性抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙烯转移酶（EPSPS）的活性，使氨基酸合成受阻而死亡，由于所有植物都需EPSPS催化氨基酸合成，所以施用草甘膦后，所有植物均被杀死，而抗草甘膦的作物能大量表达EPSPS。1999年5月，美国研究人员报告称，黑脉金斑蝶死于经基因改造的玉米花粉，欧盟成员国在舆论压力下，取消了对美国玉米的进口，陈新等人（陈新，王长永，朱成松等.转基因抗草甘膦大豆安全性评价及对环境影响的检测.江苏农业科学,2003,(6):36-40.）的研究结论也认为：种植抗草甘膦大豆后，杂草种群发生较大变化，芦苇、狗牙根等宿根性及多年生杂草发生数量大大增加，给杂草防治增加新的难度，而且基因会漂移至野生大豆。B、过程样品预处理：大豆粉碎、450μm微孔滤膜过滤（定性），定量检测还需150μm微孔滤膜再过滤。蛋白抽提：称取样品于聚丙烯离心管中，加入硼酸钠缓冲液振荡溶解蛋白，4℃离心，获得上清液。ELISA操作：孵育：加样品液及对照到酶标孔中，轻轻摇匀，并用胶带或铝箔封住酶标板，免污染和蒸发，37℃孵育1h。洗涤：人工洗涤时，将酶标板翻转，倒出微孔内液体，每孔注满洗涤液，保持60s，倒掉，如此3次，自动洗涤时，洗板机将所有孔中液体吸出，每孔内加满洗涤液，如此3次，在多层纸巾上将酶标板反放拍干。加入偶联抗体：加入偶联有辣根过氧化物酶的抗体工作液，封闭酶标板，轻轻摇晃混匀，37℃孵育1h。再次洗涤。显色：加入含有四甲基联苯胺的底物显色液，室温孵育10min。终止反应及测定：加入0.5%硫酸溶液终止颜色变化，并在30min后用酶标仪在450nm测量每孔吸光值。（2）转基因植物及其产品中Cry1Ab/Ac蛋白的试纸条检测第五节转基因食品检测实验室技术要求基因扩增检测方法由于其极高的灵敏度和特异性，如果实验室工作不规范，很容易出现问题，因此实验室的建设和技术要求颇高。比如我国有GB/T19495.2-2004。一、实验室的分区要求1、一般要求（1）设施及环境要求有条件的宜在所分隔的各个工作区域设置缓冲间，缓冲间的压力为负压（或上设抽风装置），与其相连的工作间为正压，工作间与缓冲间之间宜安装磁性连锁装置（1门开，1门关）。无条件设置缓冲间的实验室，对检测区域功能划分后，应根据后面提及的规定设置实验室压力，非工作人员免进。不同功能的工作区应是分隔独立的工作室，并有明显标志，各区间不能直通，如紧密相连，需安装物品传递舱。每个工作区域顶部应安装紫外灯，波长为254nm，数量为1支40W/20m2，等与地距离不宜超过2m。（2）工作顺序待检样品的流动应严格按单一方向进行，并遵循样品接收→混样→获取测试样品→样品制备→核酸或蛋白等提取→PCR(扩增与产物分析)或蛋白质检测→结果判定→结果表述及出具报告。2、工作区域的设置及要求（核酸检验区）试剂贮存和准备区：工作区域为正压；用于扩增的试剂应冰冻贮存。样品制备区：工作区域为负压；粉碎样品时的器皿应单独使用，所用的器具在使用前应彻底清洗并高压消毒，称取的测试样品应加盖后再移至核酸制备区。核酸制备区：工作区域为负压；已纯化的核酸应保存-20℃或-80℃，避免反复冻融，阳性和阴性标准物质DNA可调整至常用的使用浓度后分装并冰冻保存。扩增区：工作区域为负压；减少人员本区内走动（在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝），加样应在超净工作台内（气流方向选择垂流式）进行，巢式PCR的第二次加样必须在此区进行。扩增产物分析区：工作区域为负压；此区是最主要的扩增产物污染来源，应远离其他实验操作区，如果采用全自动扩增检测仪（实时荧光定量PCR仪），可将扩增区与产物分析区合并。二、质量控制与保证1、人员2、设备3、试剂所有试剂溶液宜大体积配制，小体积分装后高压灭菌保存，不宜高压灭菌的应过滤（0.22μm）除菌，PCR主混液、引物、探针应避免反复冻融。4、实验过程的质量控制阴性质控对照、阳性质控对照等。5、避免各类实验污染（1）避免扩增产物污染在PCR扩增反应液中加入UNG酶(尿嘧啶DNA-糖基化酶，uracilN-glycosylase)，并以dUTP代替dTTP可防止以前PCR扩增产物所致的遗留污染。（2）避免RNase污染操作者整个操作过程口罩和手套；玻璃器皿常规洗净后，用0.1%DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）于37℃浸泡2h，再用双蒸灭菌水漂洗2-3次，121℃、30min高压消毒后，250℃烘烤4h以上或200℃干烤过夜；溶液的处理：所有溶液应加DEPC至0.05-0.1%，室温过夜或室温下磁力搅拌20min，然后121℃、30min高压消毒、或70℃加热1h、或60℃过夜。由于DEPC在Tris溶液中极不稳定，配制Tris溶液的水应预先用0.1%DEPC处理并高压消毒，如此配制好的Tris再高压消毒后方可使用。实验操作：所有操作应在冰浴中进行以降低RNase的活性。抑制内源性RNase的活性：在实验起始阶段使用RNase抑制剂。（3）避免操作过程污染实时荧光PCR和总核酸杂交法可防止操作过程的污染，尤其是实时荧光PCR是转基因产品检测实验室重要的防污染措施之一。三、清洁1、清洁方向按检测工作流程方向进行清洁。2、清洁用具工作结束，立即清洁，用具专区域使用，不交叉使用。3、实验室空间定期紫外照射。4、实验台面及仪器设备实验台面用3%双氧水或10%次氯酸钠擦拭清洁，也可擦拭后再用紫外光照射，照射距离应不超过90cm，照射时间宜过夜。四、有毒、有害及废弃物的处理1、移液器吸头放入含有10%次氯酸钠浸泡，不少于24h。2、PCR产物含有PCR产物的所有液体及废弃物应放入含有1mol/l盐酸中浸泡，不少于6h，采用PCR-ELISA方法检测时洗板机洗版所产生的废液应收集至1mol/l盐酸中。3、琼脂糖凝胶及电泳液对含有EB或经EB（溴化乙锭）浸泡过的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液的处理：浓度大于0.5mg/ml时，加水稀释，使其浓度低于0.5mg/ml，加入KmmO4溶液氧化或次磷酸、亚硝酸钠、碳酸氢钠溶液中还原除去，或者用活性炭吸附后，将活性炭262℃焚化，琼脂糖凝胶则直接262℃焚化。五、安全防护1、紫外线在紫外线下工作应护目镜、面罩及暴露的皮肤，如果紫外灯是臭氧紫外灯，应停止照射30min后开始工作。2、EB应戴一次性腈类手套，操作宜固定在一定的区间、使用相对固定的容器。3、放射线注意个人防护。4、细菌培养物培养物及接触的器具在121℃第三章食品中有害化学物质快速检测方法第一节农药残留目前我国农药残留较为突出的是蔬菜中的农药残留问题。控制蔬菜中农药残留对人体的危害，最为有效的方法之一是加强对蔬菜中的农药残留检测的力度。传统的农药分析主要依赖于气相或液相色谱等仪器，仪器分析虽然可以检出样品中较微量的农药（10-12-10-16mol/L），但操作复杂、费时及成本高。因此发展农药残留的快速检测方法必不可少。反应原理上将快速检测农药残留的技术分为生物法和化学法。生物法中主要包括活体生物测定法（使用发光细菌或敏感性家蝇为测定材料）、分子生物学方法（免疫反应）、生物化学测定法（胆碱酯酶抑制原理）等。化学法主要是主要是根据有机磷农药在金属离子催化作用下水解为磷酸与醇，水解产物与显色剂反应，使显色剂的紫红色褪去变成无色。一、速测卡法（胆碱酯酶抑制法）1、原理将胆碱酯酶固定在白色药片上，靛酚乙酯固定在红色药片上，白色药片遇红色药品，白色药片呈天蓝色，如有有机磷或氨基甲酯类农药，酶活性抑制则不变色或浅蓝色。2、过程提取蔬菜样品→擦去泥土→剪成1cm左右碎片→取5g放入带盖瓶→加入10mL缓冲溶液→振摇50次，静置2min以上。酶活化取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。显色：用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。3、说明（1）速测卡的灵敏度农药名称检出限/（mg/kg）农药名称检出限/（mg/kg）农药名称检出限/（mg/kg）甲胺磷1.7乙酰甲胺磷3.5久效磷2.5对硫磷1.7敌敌畏0.3甲萘威2.5水胺硫磷3.1敌百虫0.3好年冬1.0马拉硫磷2.0乐果1.3呋喃丹0.5氧化乐果2.3

（2）葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。（3）当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用手指（体温）捏3min时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲溶液加的少、预反应后的药片表面不够湿润，二是温度太低。（4）红色药片与白色药片叠合反应的时间以3min为准，3min后的蓝色会逐渐加深，24h后颜色会逐渐退去。二、分光光度计法（胆碱酯酶抑制法）1、原理乙酰胆碱在胆碱酯酶的作用下水解，其水解产物与二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反应产生有色物质，该物质在412nm处有最大吸收，若有有机磷或氨基甲酯类农药，胆碱酯酶活性受抑制，有色物质生产少。2、过程提取：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡1min~2min，倒出提取液，静置3min~5min，待用。对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.lmL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸光度变化值0AD。样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值tAD。抑制率(%)=[(DA0-DtA)/DA0]×100式中：DA0——对照溶液反应3min吸光度的变化值；

DtA——样品溶液反应3min吸光度的变化值。当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。对阳性结果的样品，可用其它方法进一步确定具体农药品种和含量。3、说明（1）本方法的原理同卫生部颁布的全血中胆碱酯酶活性的分光光度法（WS/T67-1996）。（2）灵敏度农药名称检出限/（mg/kg）农药名称检出限/（mg/kg）敌敌畏0.1氧化乐果0.8对硫磷1.0甲基异柳磷5.0辛硫磷0.3灭多威0.1甲胺磷2.0丁硫克百威0.05马拉硫磷4.0敌百虫0.2乐果3.0呋南丹0.05（3）葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。（4）当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化DA0值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。（5）胆碱酯酶空白对照溶液3min的吸光度变化DA0值＜0.3的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。三、分光光度计法（胆碱酯酶抑制法）在pH8的溶液中，碘化硫代乙酰胆碱被胆碱酯酶水解，生成硫代胆碱，硫代胆碱具有还原性，能使蓝色的2，6-二氯靛酚褪色，褪色程度与胆碱酯酶活性正相关，可在600nm比色测定，酶活性越高，吸光值越低，当样品中有一定量的有机磷农药或氨基甲酯类农药存在时，酶活性收到抑制，吸光值较高。样品提取液用氧化剂氧化（次氯酸钙），可提高有机磷农药的抑制率，因而提高其测定灵敏度，过量氧化剂再用还原剂还原（亚硝酸钠），以免干扰测定。我国现行标准中对食品中的农药残留量的要求一般在0.1-5mg/kg，因此，对大多有机磷农药而言，速测法可以满足当前的需求，如果需要确认，就按照国家标准用气相、液相或气相（液相）—质谱仪进行进一步确认。酶抑制法可以实现对一类农药的多残留检测，但由于受酶敏感性和稳定性的影响，该方法灵敏度不够高（10-6级），错检、漏检比较较高，重复性也较差，难以满足低残留、定量检测的要求，由于这些局限性，一些专家甚至称现在的酶抑制农残速测法是“假警察”、“稻草人”。因此发展更为准确的快速分析技术迫在眉睫。第二节兽药残留一、概述兽药（VeterinaryDrug）：用于预防、治疗、诊断动物疾病，或者有目的地调节动物生理机能的物质。兽药残留（ResiduesofVeterinaryDrugs）：指食品动物用药后，动物产品的任何食用部分中与所有药物有关的物质的残留，包括原型药物或/和其代谢产物1、兽药的危害（1）毒性作用大环内酯类、四环素类和氯霉素类对肝脏损害，氨基糖苷类对肾脏及神经系统的损害，氯霉素类对血液系统的损害，影响粒白血病生成，致再生障碍性贫血，几乎所有抗菌药物会引起恶心、呕吐、腹胀、便秘等。（2）过敏反应青霉素类、磺胺类、四环素类常引起人过敏，尤其是青霉素，饮用奶制品而造成青霉素和磺胺类过敏反应的案例时有发生，轻者皮肤瘙痒，重者休克甚至死亡。（3）激素样作用主要表现为潜在致癌性（如己烯雌酚残留，可使孕妇所生女婴的粘膜产生癌变倾向），发育毒性（儿童早熟）及女性男性化或男性女性化现象。（4）耐药性抗微生物药物可诱导耐药菌株，这种耐药性可通过染色体或质粒而传递、转移或扩散，也可从耐药菌株转移到其他敏感菌，甚至转移到引起人类疾病的病原微生物中，这些耐药菌株可以通过食物链向人传播，增加了防治困难。（5）菌群失调长期摄食含抗菌药物残留的食品，还能使人体消化道内常在的微生物菌丛失调和直接诱导产生耐药菌株，非致病性微生物被抑制，条件致病菌过度增殖。（6）“三致”作用苯并咪唑类驱虫药如苯硫氧苯咪唑、丙硫苯咪唑对实验动物和食品动物均有致畸作用，相当低的剂量可诱发畸胎形成。（7）对环境的影响动物排泄物中的抗微生物和耐药菌株被释入环境后将污染水源和土壤，在污泥中细菌可长期保持耐药性质。而且动物排泄物中的兽药也引起环境中病菌微生物的抗药性增强。（8）影响食品贸易和经济的发展2、引起兽药残留的原因违规使用，主要体现在不遵守休药期，恶意使用违规药剂。3、各国的监管1984年，FAO和WHO联合发起并组织了食品中兽药残留立法委员会，1986年正式成立，该委员会每年召开会议，制定兽药残留最高残留限量法规及休药期法规。欧盟也建立了兽药产品委员会来配合兽药产品的许可证程序的执行。美国主要由食品和药品管理局、农业部、环保署三家机构负责兽药在食品中的残留问题。我国主要是农业部

发布了《中华人民共和国兽药管理条例》并根据此条例，2002年12月颁布了兽药的最高残留限量标准，并对兽药的检测方法颁布了系列标准方法。二、兽药残留的检测通过农业部发布的公告来看，对于兽药的检测主要是通过液相、气相及串联质谱仪进行测定，这些方法灵敏度高、重现性好，准备度高，但其缺点是样品处理较费时，繁琐，而且仪器成本较高，因此对于食品快速测定的要求来说，就显得不实用。1、盐酸克伦特罗（clenbuterol）

盐酸克伦特罗（clenbuterolCL）化学名为2－［（叔丁氨基）甲基］－4－氨基－3，5二氯苯甲醇盐酸盐，商品名称为克喘素、平喘素等，是一种人工合成的β2－肾上腺素受体激动剂。其药理作用为松弛支气管平滑肌、增加肺活量、降低气道阻力、增强支气管纤毛运动和促进痰液排出，临床上常用于防治哮喘、肺气肿等呼吸系统疾病。但当其应用剂量达治疗量的5～10倍时，盐酸克伦特罗能使饲料转化率和瘦肉率提高10％～15％，骨骼肌脂肪降低8％～15％，因此又称为“瘦肉精”，往往被非法作为饲料添加剂用于肉用动物的生产之中。不合法的使用给消费者带来危害，引起交感神经兴奋，会心跳加快，心慌，不由自主颤抖、双脚站不住，心悸胸闷，头晕乏力等神经中枢中毒后失控的现象，甚至死亡，对高血压、心脏病、糖尿病等病人的危害更大，慢性特点会导致儿童早熟。在我国是不准作为兽药使用，当然动物食品中不应检测出来，而欧盟是最低牛奶中不超过0.05μg/kg，最高牛肝脏中不超过0.5μg/kg；CAC的规定和欧盟类似，只是最高不超过牛肝脏中不超过0.6μg/kg。（1）ELISAA、原理包被针对兔抗体的羊抗体，加入盐酸克伦特罗抗体，加入系列已知浓度的盐酸克伦特罗及酶标-盐酸克伦特罗（辣根过氧化物酶），二者竞争抗体，高浓度的盐酸克仑特罗，则酶表-盐酸克伦特罗就少，酶将无色的四甲基联苯胺转化为蓝色底物，450nm测其吸光度，则吸光度就小，得到标准曲线，另取样品按标准曲线操作，得其吸光度，在标准曲线上求得样品中的盐酸克伦特罗浓度。标准曲线：A/A0×100为纵坐标，clenbuterol的量为横坐标（半对数）构成。B、样品处理饲料：粉碎后称量，加盐酸溶液，超声波萃取，离心得上清液，用NaOH溶液调节pH至7-9，离心待分析。血清样品：取禽腋下静脉血，置于离心管中，37℃，2h，放置4℃冰箱过夜，第2天离心待分析。肌肉和肝脏样品：称取样品，加入盐酸溶液，匀浆，超声波提取，离心，上清液中加NaOH溶液中和，再加入KH2PO4溶液使pH至6-8，4℃冰箱过夜，离心得上清液。用RIDAC18SPE小柱净化。对提取的克仑特罗残留物进行适当稀释，使其范围在标准曲线的50%抑制浓度。2、抗生素测定抗生素测定，国家标准、农业部行业标准、商检局标准中的测定方法概括起来，主要有3种方法，液相、气相、气（液）-质联用，即可定性，亦可定量；建立在免疫原理上的ELISA法及受体放射性方法。后面两种方法主要是用于初筛应用，由于采用了试剂盒，因此可实现快速检测；建立在抗生素抑制微生物生长的原理基础上的微生物抑制法。（1）ELISA抗生素的测定中，采用ELISA法主要是形成“抗原-抗体-抗体”复合物或者“抗体-抗体-抗原”复合物实现。所采用的酶皆为辣根过氧化物酶，酶将无色的四甲基联苯胺转化为蓝色底物，450nm测其吸光度。（2）放射受体法（RRA）样品中的抗生素经提取后，与3H标记或者14C标记的抗生素竞争细菌细胞中的抗生素特异性受体，样品中的抗生素含量越高，竞争结合的位点越多，而标记的抗生素结合位点则越少，离心分离后，清除游离的标记抗生素，加闪烁液后，用液体闪烁计数仪测定样品中的3H或14C含量cpm值（countpermin，每分钟脉冲数），该值越低，样品中抗生素含量越高。闪烁溶剂分子吸收射线能量成为激发态，再回到基态时将能量传递给闪烁体分子，闪烁体分子由激发态回到基态时，发出荧光光子。荧光光子被光电倍增管（PM）接收转换为光电子，再经倍增，在PM阳极上收集到好多光电子，以脉冲信号形式输送出去。将信号符合、放大、分析、显示，表示出样品液中放射性强弱与大小。在放射受体法中，应注意控制点的确定，所谓控制点，就是阴性与阳性的区别点。下面以氯霉素为例说明：控制点确定：只是样品必须先证明其中不含氯霉素（只要在阴性对照液的cpm值±20%波动，可认为不含氯霉素），再往其中加入0.6mL10μg/L的氯霉素标准溶液，其他过程同上述样品中氯霉素测定，测定样品中cpm值，求出平均值×1.2，即为控制点，该控制点是判断样品阴性与初筛阳性的一个界定值。本方法就是0.3μg/kg为控制点（因为样品为20g，通过计算可得）。结果判断：结果＞控制点+50，阴性，说明样品中氯霉素＜0.3μg/kg；结果≤控制点，阳性怀疑，重新测定，并对试剂盒性能监测；再结果＞控制点，阴性，结果≤控制点，初筛阳性；结果＞控制点，但不足50，重新计数，重新计数低于控制点，初筛阳性。（3）微生物生长抑制法采用的原理主要是通过抗生素会抑制微生物的生长，从而判定样品中是否含有抗生素。而判定其生长是否受到抑制的方法主要是通过抑菌圈的直径大小及是否会使2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）氧化变色来判定。该方法相比气相、液相、气（液）-质联用而言，通常样品处理很简单，而且培养时间也只需2-3h，因此在快速筛选中也显示了突出的优势。使用最普遍的微生物为嗜热脂肪芽胞杆菌，另外还有嗜热链球菌、枯草芽胞杆菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌等。由于抗生素的种类较多，有β-内酰胺类、磺胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、氯霉素类等6类，因此，通过微生物生长抑制法通常只能确定样品是否含有抗生素，但不能确定含有哪一类抗生素。A、嗜热链球菌抑制法（主要检测的抗生素属于β-内酰胺类）样品经80℃杀菌冷却后，添加嗜热链球菌菌液。培养一段时间后，嗜热链球菌开始增殖。加入代谢底物2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC），若该样品中不含抗生素或抗生素的浓度低于检