高三生物一轮复习：选择性必修3第三章基因工程知识点梳理

第三章基因工程知识点梳理第一节重组DNA技术的基本工具1.实施基因工程的最终目的：定向改造生物的遗传性状2.DNA酶的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为它的基本单位脱氧核苷酸3.限制酶（限制性内切核酸酶）的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为DNA分子的片段4.DNA连接酶的作用：能连接两个具有碱基互补配对的DNA片段之间的磷酸二酯键5.DNA聚合酶的作用：能把游离的脱氧核苷酸连接在引物的3，端6.解旋酶的作用：断开DNA两条链之间的氢键7.基因工程的基本工具：（1）分子手术刀—限制性内切核酸酶简称限制酶功能：识别和断开DNA分子的特定核苷酸序列如：EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：GAATTC，断开G,A之间的磷酸二之间,形成黏性末端Sma1EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：CCCGGG，断开C,G之间的磷酸二之间,形成平末端（2）分子缝合针—DNA连接酶功能：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。DNA连接酶有上千种，可以分为两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的E.coliDNA连接酶，只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。T4DNA连接酶既可以缝合黏性末端又可以缝合平末端，但连接平末端的效率相对较低。（3）分子运输车—基因进入受体细胞的载体外源基因怎样送入细胞?通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。8.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。在基因工程中使用的载体除了质粒还有噬菌体，动植物病毒等。9.成为载体的条件：（1）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制（2）有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选。（3）有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中（4）对受体细胞无害10.DNA的粗提取与鉴定（1）选择富含DNA的生物组织使细胞内容物溶出。材料的选取：洋葱等植物组织用研磨液（不是蒸馏水）研磨，动物组织用蒸馏水吸水涨破动物细胞。（不能选择哺乳动物成熟的红细胞原因：无细胞核和线粒体几乎不含DNA）破碎细胞（取上清液）（2）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可以初步把DNA和蛋白质分离开。（取沉淀）（3）用2mol\L的氯化钠溶液溶解DNA（取溶液）（4）用现配现用的二苯胺试剂和用2mol\L的氯化钠溶液溶解的DNA混合水浴加热5分钟，待试管冷却后呈现蓝色则证明提取了DNA注意：分离物质可以用过滤也可以用离心的方法。第2节基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建(核心）将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定二、获取目的基因的方法从基因文库中获取目的基因（1）从基因组文库中获取目的基因（2）从部分基因文库中获取目的基因（cDNA文库）化学合成目的基因用PCR获取和扩增目的基因PCR技术（1）PCR是聚合酶链式反应的缩写（2）原理：DNA半保留复制（3）前提：已知目的基因的部分核苷酸序列（4）条件：1、缓冲溶液2、DNA模板3、两种引物4、四种脱氧核苷酸（5）耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）（6）PCR扩增目的基因的过程：①高温变性95℃（解螺旋氢键断开）②低温复性（两种引物分别与母链碱基互补配对）③中温延伸（在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3，端）如此循环，目的基因呈2n增长，循环n次共消耗的引物对数：2n-1对引物。含有目的基因的数量：2n-2n（7）设计引物的要求：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基互补配对的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸。一对引物之间不能碱基互补配对，引物内不能碱基互补配对。（8）引物的作用：①确定目的基因的复制起点②延伸子链（从3，端延申子链）③添加酶切位点(在引物的5，端）（9）PCR的原理是体外DNA复制与体内DNA复制的区别体内DNA复制需要的酶：解旋酶、DNA聚合酶。复制过程的边解旋边复制PCR需要的酶：耐高温的DNA聚合酶，高温解旋不需要解旋酶，完全解开双链后再延伸出子链。体内DNA复制的结果是生成更多的DNA分子，PCR扩增出的是DNA片段（目的基因）。四、基因表达载体的构建1、基因表达载体构建的目的：（1）让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代。（2）使目的基因能表达和发挥作用2、基因表达载体的组成：启动子（有RNA聚合酶的结合位点）、目的基因、终止子，标记基因、复制原点（DNA聚合酶的结合位点）3、启动子、终止子、密码子的区别：（1）密码子有起始密码子、终止密码子，它们在mRNA上，影响基因的翻译。（2）启动子、终止子在基因的非编码区，影响基因的转录。4.在构建基因表达载体时注意的问题：（1）用同一种限制酶切割目的基因和载体为单酶切单酶切易出现的问题①目的基因的自身环化。②目的基因和运载体之间反向拼接所以在构建基因表达载体时一般使用双酶切法即用不同种限制酶切割目的基因，再用这两种酶切割运载体。5.使用限制酶切割目的基因构建表达载体时还需要注意：保留标记基因、启动子、终止子、复制原点，不破坏目的基因。五、将目的基因导入受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞（受体细胞多为体细胞或受精卵）①三种方法：1、花粉管通道法2、农杆菌转化法（常用）3、基因枪法②用农杆菌转化法把目的基因导入植物细胞的原理：农杆菌细胞内含有Ti质粒（双链环状DNA），当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合该海细胞的染色体DNA上，利用农杆菌的这个特点，从农杆菌中提取Ti质粒，把目的基因插入T-DNA中得到重构质粒，把重构质粒导入农杆菌细胞中，用此农杆菌感染绿色植物，此时目的基因会随T-DNA插入到受体细胞染色体DNA中，随受体细胞染色体DNA同步复制，同步表达。转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）将目的基因导入动物细胞（受体细胞多为受精卵）①方法：显微注射法②受精卵做受体细胞的原因：1、体积大易操作2、易表现出全能性③将目的基因导入动物细胞后需用到胚胎移植技术。（3）将目的基因导入微生物细胞①方法：Ca2+处理法②用Ca2+处理微生物细胞后，该细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。六、目的基因的检测与鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定抗原抗体杂交技术PCR技术和分子杂交技术抗虫鉴定、抗病鉴定抗原抗体杂交技术PCR技术和分子杂交技术注意：（1）PCR技术既可以扩增目的基因又可以检测目的基因是否导入受体细胞还可以检测目的基因在受体细胞中是否转录。（2）用PCR技术完成DNA片段的扩增，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。（3）PCR技术是否扩增出了目的基因，可以用琼脂糖凝胶电泳法鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。（4）琼脂糖凝胶电泳的原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（5）琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物时，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液。第一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。（6）PCR扩增目的基因和琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增的产物时需注意：①为避免外源DNA等因素的污