灯盏花素纳米晶的制备及质量评价

灯盏花素纳米晶的制备及质量评价

灯盏花素是从灯豆花中提取的通黄酮，以野生黄酮（也称为灯豆欧素）为主要成分（占95%以上）。这是治疗冠状动脉粥样硬化和其他心脑血管疾病的有效药物。纳米晶技术是近年来针对难溶性药物开发的一种新剂型，该技术以少量表面活性剂或高分子材料作为稳定剂，通过降低药物粒径至纳米级来增加难溶性药物的溶出度，从而提高药物生物利用度1材料表面1.1粒径和粒度仪Lyo-0.5型真空冷冻干燥机（上海东富龙科技股份有限公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；ACCELA型高效液相色谱系统（美国ThermoFisherScientific公司）；Zetasizer1000HSA型粒径分析仪（英国Malvern公司）；ZetaPALS型粒度仪（美国Brookhaven仪器公司）；MerlinCompact型场发射扫描电镜（德国Zeiss公司）；D8Advance型X射线粉末衍射（XRPD）仪（德国Bruker公司）；DSC-60型差示扫描量热（DSC）仪（日本Shimadzu公司）；KYC-100B型恒温培养摇床（上海福玛实验设备有限公司）；ZRS-8G型智能溶出度试验仪（天津市盛鑫通达科技有限公司）；立式砂磨机（沈阳化工研究院）。1.2试剂：十二烷基硫酸钠sdsBRE原料药（珠海远城医药化工有限公司，批号：20180301，纯度：95.30%）；野黄芩苷对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：20180204，纯度：≥98%）；吐温80（天津市福晨化学试剂厂，批号：20170822）；乳糖、十二烷基硫酸钠（SDS）（天津市大茂化学试剂厂，批号：20170902、20170812）；泊洛沙姆（德国BASF公司，批号：WPCE565D）；聚维酮K30(PVPK30，安徽山河药用辅料有限公司，批号：20170924）；葡萄糖（山东瑞泰化工有限公司，批号：20171124）；甘露醇（北京化学试剂厂，批号：20170823）；水为纯化水。2方法和结果2.1bre纳米晶悬浮液的参数研究相关研究发现，研磨介质的粒径、用量以及研磨时间对纳米晶制备工艺有一定的影响2.1.1bre纳米晶混悬液的制备称取BRE原料药7.5g，置于含有吐温80(1.125g）的水溶液（22.5mL）中，搅拌混悬，再加入不同粒径（0.6、0.8、1.0、2.0mm）的氧化锆珠450g，研磨1h，分别制备3批BRE纳米晶混悬液。以BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI为指标，筛选最优研磨珠用量。结果，直径为0.6mm的氧化锆珠所制备的BRE纳米晶混悬液的粒径和PDI较小，因此确定研磨珠粒径为0.6mm。研磨珠粒径的筛选结果见图1。2.1.2批bre纳米晶混悬液的制备称取BRE原料药7.5g，置于含有吐温80(1.125g）的水溶液（22.5mL）中，搅拌混悬，再加入不同用量（390、420、450、480g）的氧化锆珠（粒径为0.6mm），研磨1h，分别制备3批BRE纳米晶混悬液。以BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI为指标，筛选最优研磨珠用量。结果，随着氧化锆珠用量的增加，BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI逐渐减小；但氧化锆珠用量增加到一定程度时，BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI反而增加，因此确定氧化锆珠的用量为450g。研磨珠用量的筛选结果见图2。2.1.3bre纳米晶混悬液的制备称取BRE原料药7.5g，置于含有吐温80(1.125g）的水溶液（22.5mL）中，搅拌混悬，加入氧化锆珠（粒径为0.6mm)450g，分别研磨0.5、0.75、1.0、1.5h，制备3批BRE纳米晶混悬液。以BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI为指标，筛选最优研磨时间。结果，随着研磨时间的延长，BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI逐渐减小；研磨0.5、0.75、1.0h时，BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI减小的幅度较大；研磨1.5h时，BRE纳米晶混悬液粒径虽然较研磨1.0h时的粒径减小，但减小幅度不大。综合考虑能耗和时间，确定研磨时间为1h。研磨时间的筛选结果见图3。2.2黑市纳米晶体混合悬浮液的制备相关研究发现，将难溶性药物研磨成纳米级的粒子后，能产生较高的表面能，进而导致粒子的粒径增加，失去纳米晶药物特有的物理、化学优势2.2.1稳定剂的筛选称取BRE原料药7.5g若干份，分别置于含有8%、12%、15%、18%不同稳定剂（泊洛沙姆、吐温80、SDS、PVPK30）的水溶液（22.5mL）中，搅拌混悬，加入氧化锆珠（粒径为0.6mm)450g，研磨1h，分别制备3批BRE纳米晶混悬液。以BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI为指标，筛选最优稳定剂种类和比例。另外，为了充分比较稳定剂种类和比例对BRE纳米晶混悬液稳定性的影响，笔者还考察了将其避光放置7d后的粒径、PDI情况。结果，15%吐温80和15%SDS作为稳定剂所制得的BRE纳米晶混悬液放置0、7d的粒径变化不大，稳定效果较好；由于SDS在研磨过程中会产生大量泡沫，影响药物的回收，因此确定稳定剂为15%吐温80。稳定剂种类和比例的筛选结果见图4、图5。2.2.2bre比例的确定分别称取BRE原料药4.5、6、7.5、9g（在BRE纳米晶混悬液中的比例分别为15%、20%、25%、30%），分别置于含有15%吐温80的水溶液（水用量分别为25.5、24.0、22.5、21.0mL）中，搅拌混悬，加入氧化锆珠（粒径为0.6mm)450g，研磨1h，分别制备3批BRE纳米晶混悬液。以BRE纳米晶混悬液的粒径、PDI为指标，筛选最优BRE比例。结果，随BRE比例的增加，BRE纳米晶混悬液的粒径和PDI均先逐渐减少后逐渐增大；当BRE比例为25%时，BRE纳米晶混悬液的粒径和PDI最小，因此确定BRE比例为25%。BRE比例的筛选结果见图6。2.2.3bre纳米晶的制备取BRE原料药7.5g（在BRE纳米晶混悬液中的比例为25%），置于含有15%吐温80的水溶液（22.5mL）中，搅拌混悬，加入氧化锆珠（粒径为0.6mm)450g，研磨1h，平行制备3批BRE纳米晶混悬液，并测定其粒径和PDI。结果，BRE纳米晶混悬液的平均粒径为（278.03±4.85)nm，平均PDI为0.192±0.012。2.3不同冻干工艺样品以BRE纳米晶冻干前后体积变化不大，冻干后不皱缩、无塌陷，色泽均匀、无花斑，有韧性，轻轻捻磨即成粉状，加原体积的水可迅速恢复至冻干前状态，且粒径和PDI与混悬液状态所测结果无显著性差异为其冻干工艺合格的筛选标准2.3.1不同保护剂种类对bre纳米晶粒径和pdi的影响取“2.2.3”项下制得的BRE纳米晶混悬液15mL，分别加入冻干保护剂5%甘露醇、5%葡萄糖、5%乳糖各0.75g，同时考察不加入冻干剂的情况（不需振摇），振摇使其溶解均匀，分装于25mL西林瓶中，于-40℃条件下预冻5h后，加热升温至-20℃，维持此温度20h后，加热升温至20℃，并维持此温度5h，即得BRE纳米晶。观察所制BRE纳米晶的外观，并取适量以水溶解后，测定其粒径和PDI。平行试验3次，以筛选冻干保护剂种类。结果，加入冻干保护剂和不加冻干保护剂对BRE粒径和PDI的影响差异不大，因此，选择不加冻干保护剂。冻干保护剂的筛选结果见表1。2.3.2bre纳米晶的制备取“2.2.3”项下制得的BRE纳米晶混悬液15mL，分装于25mL西林瓶中，按“2.3.1”项下“于-40℃条件下预冻5h后……并维持此温度5h”的步骤操作，平行制备3批BRE纳米晶。观察所制BRE纳米晶的外观，并取适量水溶解后，测定其粒径和PDI。结果，BRE纳米晶混悬液冻干后不皱缩、无塌陷，色泽均匀、无花斑，平均粒径为（283.09±3.51)nm，平均PDI为0.212±0.017。2.4bre纳米结晶中野生黄酮含量测定的建立2.4.1条件1色谱柱为DiamonsilC2.4.2对照品贮备液的制备精密称取野黄芩苷对照品10mg于25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度为400μg/mL的对照品贮备液；精密吸取750μL对照品贮备液于5mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度为60μg/mL的野黄芩苷对照品溶液。2.4.3溶出度的测定精密称取“2.3.2”项下制备的BRE纳米晶15mg（相当于含BRE10mg），参照2015年版《中国药典》（四部）中溶出度测定第三法（小杯法）2.4.4空白辅料溶液按“2.2.3”项下处方比例和方法制备无BRE的空白辅料混悬溶液，按“2.3.2”项下方法制备无BRE的空白纳米晶，再按“2.4.3”项下方法制备空白辅料溶液。2.4.5进样分析结果取上述野黄芩苷对照品溶液、供试品溶液、空白辅料溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，野黄芩苷的峰形对称，且空白辅料对其色谱峰无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图7。2.4.6线性范围试验分别精密量取“2.4.2”项下野黄芩苷对照品贮备液0.06、0.125、0.25、0.75、1.00、1.25mL至5mL量瓶中，加甲醇稀释制成质量浓度分别为4.8、10、20、60、80、100μg/mL的系列线性溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过后，取续滤液，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以野黄芩苷质量浓度为横坐标（x，μg/mL）、峰面积为纵坐标（y）进行回归分析，得回归方程为y=21485x-25461(r=0.9996），表明野黄芩苷质量浓度线性范围为4.8～100μg/mL。2.4.7检测限和定量限取“2.4.6”项下制备的质量浓度为4.8μg/mL的野黄芩苷对照品溶液适量，用甲醇倍比稀释，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，以信噪比3∶1、10∶1分别计算检测限和定量限。结果，野黄芩苷的检测限为0.0668μg/mL，定量限为0.1315μg/mL。2.4.8稳定性试验取“2.4.6”项下制备的质量浓度为60μg/mL野黄芩苷对照品溶液适量，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，野黄芩苷峰面积的RSD为1.49%(n=6），表明仪器精密度良好。2.4.9进样分析条件取“2.4.3”项下供试品溶液适量，于室温放置0、2、4、6、8h后，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，野黄芩苷峰面积的RSD为0.71%(n=5），表明供试品溶液在室温放置8h内稳定性良好。2.4.1加样回收率试验精密称取已知野黄芩苷含量的BRE纳米晶3mg，置于100mL量瓶中，分别精密加入野黄芩苷对照品贮备液5mL，加水稀释至刻度，然后用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，平行制备6份，再按“2.4.1”项下色谱条件进样分析并计算加样回收率。结果，野黄芩苷的平均加样回收率为100.15%(RSD=1.83%,n=6），表明方法准确度良好。加样回收率试验结果见表2。2.5bre纳米晶体的质量分析2.5.1粒径和pdi的测定取“2.3.2”项下制备的BRE纳米晶样品适量，加水溶解，采用粒度仪测定其粒径、PDI，平行测定3次。结果，BRE纳米晶的平均粒径为（283.10±3.08)nm，平均PDI为0.212±0.021，且粒径分布较窄、呈正态分布，详见图8。2.5.3e纳米晶的表征取适量BRE原料药和“2.3.2”项下制备的BRE纳米晶预先进行真空喷金处理，再采用扫描电镜观察两者的表面和晶体结构。结果，BRE原料药主要以针状结构存在，BRE纳米晶主要以棒状结构存在，详见图9。2.5.4bre纳米晶的表征分别取“2.3.2”项下制备的BRE纳米晶、吐温80、BRE原料药各5mg，进行DSC分析。设置气氛为干燥空气，温度范围为30～350℃，升温速率为10℃/min，三氧化二铝为参比物。结果，BRE原料药在136.96、210.79℃处有吸热峰，在213.6℃处有放热峰；吐温80的DSC曲线没有吸热、放热峰，表明其为无定形状态；BRE纳米晶在131.83、198.55℃处有吸热峰，在202.27℃处有放热峰，表明BRE纳米晶仍以晶体形式存在，且晶体形态没有发生改变，详见图10。根据Van’tHoff方程可知，当物质中有微量杂质存在时，其熔点会降低、熔距会变宽2.5.5bre纳米晶的形态表征分别取BRE原料药和“2.3.2”项下制备的BRE纳米晶适量，进行XRPD分析。选择Cu靶，设置管压为40kV、管流为40mA、扫描速度为4°/min、2θ角扫描范围为5°～40°。结果，BRE原料药在10.10°、14.85°、15.93°、25.61°、26.86°有较强的衍射峰，BRE纳米晶在对应位置也有较强的衍射峰出现，表明BRE纳米晶和原料药具有相同的晶体形态，且无新的晶型出现，详见图11。由此可知，介质研磨和冷冻干燥过程并未改变BRE的晶体形态。2.5.6bre纳米晶的外溶度测定参考2015年版《中国药典》（四部）中溶出度测定第三法（小杯法）2.5.7粒径和zeta电位取3批“2.3.2”项下制备的BRE纳米晶，于温度为（40±2）℃、相对湿度为（75±5）%的条件下，避光放置3个月，然后测定其粒径、PDI和Zeta电位，并按“2.5.6”项下方法测定其累积溶出度。结果，BRE纳米晶放置3个月后其粒径、PDI、Zeta电位、累积溶出度均未有明显改变，表明其稳定性较好。BRE纳米晶加速稳定性考察结果见表3，放置3个月后的溶出曲线见图12。3介质研磨和冻干处理对bre纳米晶和分本课题组在进行BRE纳米晶制备工艺考察时发现，BRE的粒径随着氧化锆珠用量的增加而减小，但增加到一定程度后，BRE的粒径反而增加。相关研究发现，适宜的研磨时间能使药物颗粒被充分碰撞