克氏原螯虾用产芽孢益生菌的特性研究

克氏原螯虾用产芽孢益生菌的特性研究

抗生素促进了水产养殖的快速发展，但由于滥用而造成的药物残留和对病原体的耐药性等问题日益突出。芽孢杆菌属(Bacilluscohn)的益生菌是具有潜力的替代抗生素的产品。据文献报道和生产实践，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)等在水产养殖中表现出多种有益作用，包括促生长、激活免疫应答、提高抗病力、净化水质等(受利益驱动，益生菌制造商通常过于关注益生效应，而对其安全性评价的重视度不够(在克氏原螯虾(Procambarusclarkii)的规模化养殖中常大量使用芽孢杆菌，为了解市售产品的现状，本研究从动保产品中分离出19株芽孢杆菌，并评价其益生作用、稳定性和安全性，以期望对动保产品中芽孢杆菌的科学评价和合理使用提供参考。1结果与分析1.1bacies反应从市售样品共分离到19株芽孢杆菌属的成员，其中5株(B8,B14,B18,B23,B40)为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),10株(B10,B20,B21,B22,B24,B27,B41,B42,B43,B44)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),2株(B26,B38)为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus),1株(B31)为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis),1株(B45)为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。1.2益生功能评价1.2.1病原菌无抑制作用有13株芽孢杆菌对测试的某种或几种病原菌有抑制作用，6株(B10,B26,B38,B41,B42,B43)对测试病原菌无抑制作用；14株芽孢杆菌可以降解纤维素，5株(B21,B31,B38,B41,B44)不能降解纤维素酶(表1)。1.2.2菌落生长情况培养温度为15℃时，生长速度排前3位的菌株是分别是B14、B26和B40，而B17、B22、B31、B41、B44、B45株在272h肉眼未见菌落。培养温度为25℃时，生长最快的菌株是B26和B45。当培养温度是37℃时，生长最快的菌株是B42和B18(图1)。1.3稳定性评估1.3.1芽孢对高温、低ph和时间的热处理分离株B14、B18、B21、B22、B31、B38、B44的芽孢可完全耐受90℃、10min的热处理。分离株B14、B21、B22、B31、B38、B44的芽孢可完全耐受100℃、5min的热处理。除了分离株B41和B44的芽孢外，其余芽孢能耐受pH=1溶液处理2h。除分离株B8和B45株的芽孢外，其余芽孢能耐受10%胆汁酸处理2h(表2)。1.3.2芽孢杆菌的自聚集性在37℃孵育24h后，除B18、B20、B26、B38外，其余芽孢杆菌的自聚集性均到达70%以上。分离株的表面疏水性均不高，最高为B38株，其表面疏水率为27.78%(图2)。1.4安全评估1.4.1益生菌对15种药物的敏感性利用K-B法测19株芽孢杆菌对14种常用抗菌药物的敏感性，其中B10、B24和B31对氨苄西林耐药，B18、B22和B23对四环素耐药，B21对氟苯尼考耐药，B23和B24还对多西环素耐药，B40对甲氧氨苄嘧啶耐药，其余的益生菌对14种常用抗生素均敏感或中敏(表3)。1.4.2第二、高血小板-溶血活性有8株芽孢杆菌(B10,B14,B21,B24,B26,B40,B43和B45)具有β-溶血活性(图3)，这些菌株能否作为益生菌的候选株，还需要进行动物安全试验。1.4.3大鼠疾病选择能抗病原菌、产纤维素酶和15℃下生长良好、但有溶血活性的B14和B40菌株，进行动物安全试验。慢性攻毒试验(101.4.4饲料转化效率的影响因素实验组的增重率和特定生长率的平均值高于对照组的，表明B14和B40对克氏原螯虾的生长具有一定的益生作用。实验组的料肉比的平均值均比对照组的要高，这也提示B14和B40对克氏原螯虾的饲料转化效率存在着负面影响(表4)。在解剖A、B、C实验组的克氏原鳌虾时，发现其肠道充血，而对照组D组并没有出现肠道充血(图4)。在植物分类等级门的水平上，各实验组和对照组之间的细菌群落组成相对丰度的变化不大；但在属水平上，B14、B40、B14和B40处理组的气单胞菌属(Aeromonas)相对丰度分别为(35.29±5.98)%、(17.12±6.71)%、(34.90±26.57)%，均高于对照组的(9.85±1.35)%,且差异显著(图5)。2对克氏原螯虾的影响拮抗病原菌、具备产纤维素酶活性，是筛选水产用益生芽孢杆菌的常见指标(Guoetal.,2016;B14和B40菌株存在溶血活性，但在小鼠急性或慢性攻毒试验中，并未证实其有害影响。B14和B40菌株对克氏原螯虾生长影响的试验结果表明，B14和B40菌株有促进生长的作用，但又存在降低饲料转化效率的作用。在解淀粉芽孢杆菌B14和B40株可引起克氏原螯虾肠炎。具有溶血活性的益生菌蜡样芽孢杆菌可引起小鼠肠炎(制药和生物技术公司推进了益生菌商业化，但越来越多的动物用益生菌被发现可能存在安全隐患。如3材料和方法3.1菌株和培养基含有芽孢杆菌的市售动保产品。金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC25923)、嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila(17J051)、大肠杆菌Escherichiacoli(ATCC25922)、凡隆气单胞菌Aeromonasveronii(17J071)由本实验室保存。3.2选择芽杆菌的分离和鉴定参考3.3益生功能分析参考采用单菌落NA平板培养法测定分离的芽孢杆菌在15、25、37℃的生长速度。至少测定3个重复。3.4稳定性分析参考Guo等(2016)的方法测定芽孢杆菌的芽孢对高温、低pH和高胆汁酸盐的耐受能力。3.5动物试验和投喂芽孢杆菌对抗生素的敏感性分析。采用K-B法测试芽孢杆菌对14种常用抗生素的敏感性，参照芽孢杆菌溶血性分析。分离的芽孢杆菌在兔血平板上进行划线。37℃下培养24h，观察是否出现溶血圈。小鼠致病性分析。综合抗菌活性、产纤维素酶活性，选择15℃生长最快的B14和B40为获选株。为确定有溶血活性的B14和B40株的安全性，进行下面的动物试验。B14、B40菌株分别在TSB中经37℃、24h增菌，PBS洗涤后调整菌液浓度分别达到10对克氏原鳌虾生长和肠道微生态的影响。用PBS将B14和B40菌株洗涤后调整浓度至10在2周以上的试验环境适应中，剔除死亡虾。剩余活力好的虾(80只)分为A、B、C、D共4个组。称量实验虾的初始体重后，连续投喂20d，记录每天投喂饲料量，试验结束称量虾的终体重。每组选取6只虾采集肠道内容物，送联川生物公司进行16SrDNA测序。3.6间差异的分析所有的实验结果均表示为均值±标准差，组间差异用单因素ANOVA分析。P<0.05时认为有统计学差异。所有统计学分析均采用统计学软件SPSS19.0完成。数据