铁线莲‘风之森林’叶绿素提取工艺研究

铁线莲‘风之森林’叶绿素提取工艺研究

铁线莲是毛科和铁线莲科的总称。多年生植物生长良好，色彩丰富，是园林品种的优良品种。大多数植物具有很高的药用价值，是具有一定的抗逆性的重要药物用途。叶绿素是高等植物和其他所有能进行光合作用的生物体含有的主要色素，直接参与光能的传输、分布和转换等过程.其含量不仅体现植物的光合作用能力、发育变化过程、生长情况、生理代谢程度及营养要求，还可作为环境生理研究的重要参照标准1材料和方法1.1材料和试剂铁线莲‘风之森林’叶片、无水乙醇、纯丙酮、碳酸钙.1.2设备和设备752型紫外分光光度计、石英比色皿、万分之一电子分析天平、剪刀、研钵、容量瓶、试管.1.3丙酮溶液及丙酮水5.5%乙醇溶液先按照体积比配置一定量提取溶液待用，即80%丙酮溶液、95%乙醇溶液、丙酮与无水乙醇（1:1）和丙酮：无水乙醇：水（4.5:4.5:1）.丙酮处理时需注意实验室通风，戴口罩，不使用时保持紧密并避免受损.1.4测试方法1.4.1叶绿素含量的测定—研磨法以提取溶液80%丙酮为例，在铁线莲‘风之森林’植株上选择生长发育情况良好、无病虫害的叶片，洗净，滤纸吸干，剪去大叶脉，其余叶片剪碎.使用天平精准称取0.2g叶片放入研钵中，然后加入80%丙酮2-3ml及少量碳酸钙进行研磨，磨成匀浆后，将其滤到25ml容量瓶中，然后用相应提取液把研钵、滤纸和杂质清洗至白色，将洗涤液滤到容量瓶中，最后用80%丙酮定容到25ml，上下倒置充分混合均匀.将叶绿素提取液倒入石英比色皿中，以对应提取剂为比较组，在紫外分光光度计下测波长645nm和663nm下的吸光度，根据Arnon法把叶绿素a和叶绿素b的含量计算出来.用95%乙醇溶液、丙酮与无水乙醇（1:1）和丙酮：无水乙醇：水（4.5:4.5:1）提取液作对比试验，每种提取液都要重复三次试验.1.4.2铁线莲叶绿素含量的测定以提取液80%丙酮为例，叶片前期处理如研磨法，精准称取0.2g叶片，快速放于10ml试管中，加入少量碳酸钙和10ml提取液，并置于培养箱中黑暗浸泡24h，注意不时摇晃.24h后，取出待测铁线莲，将试管中绿色液体倒入25ml容量瓶中，最后用80%丙酮定容到25ml，充分混合均匀.后续处理与研磨法相同，即使用比色皿在分光光度计上测量相应波长下的吸光度值，使用公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量.1.5处理数据叶绿素含量的计算：式中叶绿素含量的单位为mg/g,A2结果与分析2.1种提取剂提取叶绿素含量的比较四种提取溶液对叶绿素提取效果的比较.试验结果见表1-1、表1-2、表1-3.从表中数据可以看出在室温条件下不同提取溶液对叶绿素提取效果不同.其中三次重复试验均表明研磨法提取效果最好的提取剂为丙酮与无水乙醇（1:1），叶绿素a的含量分别为1.333、1.220、1.253mg/g，叶绿素b的含量分别为0.545、0.455、0.472mg/g，总叶绿素含量分别为1.878、1.675、1.725mg/g.其次为丙酮：无水乙醇：水（4.5:4.5:1），再次是95%乙醇溶液，叶绿素提取含量最低的提取剂是80%丙酮溶液，叶绿素a的含量分别为0.818、0.914、0.861mg/g，叶绿素b的含量分别为0.260、0.324、0.320mg/g，总叶绿素含量分别为1.078、1.238、1.181mg/g.每种提取溶液的三次重复试验中，叶绿素含量有些许差别，可能与每次试验过程前叶片的选择和处理以及研磨过程中的研磨不完全有关，也可能与三次处理在空气中暴露时间不同有关.且三次试验处理时间不同，都有可能影响叶绿素含量.但四种提取剂的三次试验中，关于叶绿素研磨法提取效果由高到低的结果最终是相同的.在前人研究的基础上，了解到碳酸钙具有减弱叶绿素分解的作用2.2丙酮与丙酮的提取效果比较四种提取溶液对叶绿素提取效果的比较.使用浸提法不同提取溶液对‘风之森林’叶绿素提取的影响结果见表2-1、2-2和2-3.由表可知，三次重复试验均表明浸提法提取效果最佳的提取溶液为丙酮与无水乙醇（1:1），由高到低依次为丙酮：无水乙醇：水（4.5:4.5:1）、95%乙醇溶液、80%丙酮溶液.结果也表明丙酮与无水乙醇（1:1）和丙酮：无水乙醇：水（4.5:4.5:1）这两种提取效果高于80%丙酮溶液和95%乙醇溶液.这也与其他相关叶绿素含量测定试验的结果相同，证实了浸提法提取叶绿素中混合溶液比单一溶液好，并了解到这可能是一种协同萃取作用，存在乙醇与丙酮之间，这种作用可以使叶绿素提取速度加快，从而高于单一溶液.在单一溶剂中，95%乙醇溶液提取效果又比80%丙酮溶液好，说明80%丙酮在提取叶绿素方面不充分，这是因为丙酮容易挥发，提取溶液少而影响叶绿素的提取.这与其他对柿树、玉米和菠菜等关于叶绿素含量的试验结果一致.而在查阅相关文献中，这一结果又与古川照雄用无水乙醇提取叶绿素的研究有一定的差别，他的研究则表明乙醇提取叶绿素不完全.张宪政也指出此种方法充分提取叶绿素所需时间长，对某些植物来说可能提取不够充分，精确度不高，所以这种方法的应用也不普遍2.3两种提取方法的比较结果首先从总体上看研磨法和浸提法关于提取叶绿素效果最佳的提取剂都为丙酮与无水乙醇（1:1），且提取剂提取叶绿素含量由高到低都依次为丙酮：无水乙醇：水（4.5:4.5:1）、95%乙醇溶液、80%丙酮溶液.由上面六个表可知，浸提法提取叶绿素a的含量、叶绿素b的含量和总叶绿素含量都显著高于研磨法.使用研磨法，这四种提取剂所提取的叶绿素含量都显著低于浸提法，大概是因为在研磨过程中对‘风之森林’叶片研磨不彻底，研磨时间比较短，提取叶片叶绿素时间也相对短，叶绿素提取不完全且研磨时也会加快叶绿素的分解速度，这就会导致提取的叶绿素含量少.研磨时也可能会因为破坏了叶绿素的结构使提取后的叶绿素不稳定，见光时易分解3叶绿素提取方法的确定试验结果表明，无论是使用研磨法还是浸提法，提取叶绿素效果最佳的选择都是丙酮与乙醇（1:1）.然后比较两种方法，研磨法步骤较多，工作量大，效率低速度慢，研磨过程会造成叶绿素的大量损失.而浸提法操作简单，效率高速度快，浸提过程中叶绿素损失少，提取相对完全，对于进行大批量叶片叶绿素含量测定具有重要实际意义.且由上述试验数据可知浸提法优于研磨法.因此，利用浸提法，采用丙酮与无水乙醇（1:1）提取液提取‘