乳酸菌破壁技术的研究

乳酸菌破壁技术的研究

蘑菇是一种重要的工业蘑菇，在食品发酵中得到了重要的经济价值。其合成代谢产物具有降胆固醇、降血压、抗肿瘤和提高机体免疫等作用细胞破壁方法很多,如:化学法,如酸热法、化学渗透法;物理法,如反复冻融法、超声破壁法、机械法和微波法等;生物法,如酶溶法等,各有优缺点1材料和方法1.1培养基和仪器菌株Lactobacillus.plantarum1.557本实验室保存;质粒pSIP411山东大学祁庆生教授惠赠;MRS培养基青岛高科园海博生物技术有限公司;甘氨酸Promega公司;溶菌酶购自北京索莱宝科技有限公司;革兰氏染色液购自天津市光复精细化工研究所;Trizol购自Invitrogen公司;RIPA裂解液(强)P0013购自碧云天公司;4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)购自上海宝曼生物科技有限公司。超声波破碎仪宁波新芝科器研究所;MCO-18M型CO1.2实验方法1.2.1培养基和培养方法将L.plantarum1.557MRS平板培养基上新鲜活化的单菌落挑至5mLMRS液体培养基,37℃静置培养过夜。12000r/min,离心1min,收集菌体。用1mL预冷的洗涤液(100mmol/L磷酸缓冲液,10mmol/LEDTA)洗涤菌体,洗涤3次,再用PBS洗涤3次,离心,收集菌体。1.2.2清洗苏逻辑的测定用5.8mol/LHCl覆盖氧化锆磨介,室温振荡处理过夜。弃上清,加入灭菌水清洗(每次清洗都要反复振荡),共洗10次。最后,放入平皿中铺散开,75℃烘干备用1.2.3蘑菇壁处理1.2.3.氧化锆珠研究法用1.5mL离心管称取0.013g左右的菌体,加入300μL预冷的RIPA裂解液并重悬菌体,再加入1g左右预冷的氧化锆珠。放入组织研磨仪中振荡研磨(振荡频率为每秒30次)研磨15min。研磨结束后,用1mL注射器在研磨后的离心管底部扎一个小孔,并将扎孔的离心管立即放入另一新的预冷的1.5mL离心管,4℃,5000r/min,离心5min,收集研磨后的蛋白上清和菌体1.2.3.低功率400w热压法用1.5mL离心管称取2管相同重量(0.01g左右)的菌体,加入300μL预冷的RIPA裂解液并重悬菌体。在冰浴条件下分别超声破碎30min和1h(功率400W,工作30s,间隔30s)。超声结束后,4℃,12000r/min,离心5min,收集超声后的蛋白上清和菌体1.2.3.超声破碎法用1.5mL离心管称取2管相同重量(0.01g左右)的菌体,加入300μL预冷的RIPA裂解液并重悬菌体。在冰浴条件下进行超声破碎20min(功率1500W,工作5s,间隔9s)。超声结束后,4℃,12000r/min,离心5min,收集超声后的蛋白上清和菌体1.2.3.改造ripa裂解液用1.5mL离心管称取重量为0.013g左右的菌体,加入300μL预冷的RIPA裂解液并重悬菌体。于液氮中反复冻融3次,每次冷冻时间20min,37℃水浴中解冻20min1.2.3.含溶菌酶的pbs用1.5mL离心管称取重量为0.013g左右的菌体,将菌体重悬于300μL含溶菌酶(10mg/mL)的PBS(pH8.0)。在37℃水浴中处理30min,处理结束后,12000r/min,离心5min,收集溶菌酶处理后的蛋白上清和菌体1.2.3.菌株的培养将L.plantarum1.557MRS平板培养基上新鲜活化的单菌落挑至5mL含2%甘氨酸的MRS培养基中,37℃静置培养过夜。然后,按照方法1.2.1收集菌体。1.2.3.氧化锆珠研磨法用1.5mL离心管称取2管相同重量(0.013g左右)的菌体。然后,按照方法1.2.3.4反复冻融菌体3次,解冻后,直接加入1g左右预冷的氧化锆珠,放入组织研磨仪中振荡研磨(振荡频率为每秒30次),分别在研磨5min后,10min后取出一管,置于冰上。然后,用1mL注射器在研磨后的离心管底部扎一个小孔,并将扎孔的离心管立即放入另一新的预冷的1.5mL离心管,4℃,5000r/min,离心5min,收集研磨后的蛋白上清。1.2.3.氧化锆珠研磨法用1.5mL离心管称取2管相同重量(0.013g左右)的菌体。然后,按照方法1.2.3.5用溶菌酶处理菌体30min,处理结束后,分别直接加入1g左右预冷的氧化锆珠,接下来按照方法1.2.3.7进行氧化锆珠研磨和收集研磨后的蛋白上清。1.2.3.氧化锆珠的制备按照方法1.2.3.6用2%甘氨酸处理菌株并收集处理后的菌体。用1.5mL离心管称取2管相同重量(0.013g左右)的菌体,分别加入300μL预冷的RIPA裂解液并重悬菌体,再分别加入1g预冷的氧化锆珠。接下来按照方法1.2.3.7进行氧化锆珠研磨和收集研磨后上清。1.2.4兰染色对分别经氧化锆珠破碎、超声破碎、反复冻融、溶菌酶处理、甘氨酸处理的菌体进行革兰氏染色,按照革兰氏染色液试剂盒说明书来进行操作。1.2.5sds-采用分析从收集的蛋白上清中各取50μL,直接加入12.5μL5×SDS样品缓冲液,充分混匀,煮沸5min,各取15μL煮沸后样品进行12%SDS分析。1.2.6培养基和方法将菌株L.plantarum1.557(已电转入了质粒pSIP411)在MRS平板培养基上活化后的单菌落挑至5mLMRS液体培养基,37℃静置过夜培养。以1%(V/V)的接种量转接到6mLMRS液体培养基(红霉素15μg/mL)中,37℃静置培养4h(OD=0.3左右)。培养4h后,取出3mL菌液加入诱导剂SppIP(100ng/mL),剩余3mL菌液不加诱导剂作为对照。然后,继续培养6h。按照方法1.2.1和1.2.3.1进行菌体和蛋白上清的收集。取诱导和未诱导的研磨上清各50μL,分别加入500μL含1.25μmol/L4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)的GUSBuffer(pH=750mmol/L磷酸缓冲液10mmol/Lβ-巯基乙醇1mmol/LEDTA0.1%TritonX-100,37℃温育,观察颜色变化1.2.7氧化锆珠研磨法用1.5mL离心管称取6管相同重量(0.01g左右)的菌体,分别加入300μL预冷的Trizol并重悬菌体,再分别加入1g左右预冷的氧化锆珠。然后,将其中的5管放入组织研磨仪中振荡研磨(振荡频率为每秒30次),另外1管不研磨作为对照。然后,分别在研磨5、10、15、20min后取出一管,置于冰上。接下来按照方法1.2.3.1收集菌体碎片和上清,用上清重悬菌体碎片后,接下来按照Trizol总RNA提取法进行RNA的提取并用NanoDrop2000紫外分光光度仪测定RNA浓度。2结果与分析2.1一些简单的中断方法的分析2.1.1菌体蛋白无法释放由图1可知,甘氨酸破壁法(A、B)、反复冻融破壁法(E、F)仅可使菌壁受到一定程度破坏(破壁处理后,革兰氏染色菌体变红),但无法破坏整个细胞结构,菌体蛋白无法释放。低功率(400W)超声波破壁法(I、K)在超声30min后,细胞结构仍比较完整,菌体破碎不完全,需要较长时间(1h左右)才可破坏整个细胞结构。而氧化锆珠破壁法(G、H)、大功率(1500W)超声波破壁法(L、M)、溶菌酶破壁法(C、D)这三种方法都可在较短时间内(15~30min)破坏完整细胞结构,使菌体蛋白得到释放。2.1.2sds-东南角分析由图1可知,甘氨酸破壁法和反复冻融破壁法无法有效破坏细胞结构,菌体蛋白释放不完全。因此,我们只对溶菌酶破壁法、氧化锆珠破壁法、超声波破壁法进行了SDS分析。由图2可知,溶菌酶虽然可以破坏菌体完整细胞结构,但PAGE条带的数目却缺少许多,说明仍有许多菌体蛋白没有释放到上清中。大功率(1500W)超声波破壁法和低功率(400W)超声波破壁法的PAGE图片条带数目少且清晰度差,说明菌体蛋白收获不完全。氧化锆珠破壁法的PAGE图片条带数目多且清晰度高,说明菌体蛋白收获较完全。2.2不同复合方法研磨法结果比较由图1、图2可知,上述几种破壁方法对乳酸菌的菌壁均有一定程度的破坏作用,为了进一步提高其破壁效率,又将不同的破壁方法相叠加对乳酸菌进行复合处理。由图3可知,菌体不经任何处理,加入RIPA后直接锆珠研磨(单纯氧化锆珠破壁法),在研磨5min后,PAGE条带数少很多(尤其30kD以下),研磨不充分,但在研磨10min后,PAGE条带数多且清晰度高,说明菌体蛋白收获较完全。对于几种复合处理方法,只有甘氨酸-研磨复合破壁法,在研磨5min后,就达到了单纯氧化锆珠破壁法研磨10min的效果,在破壁时间上略有缩短。而溶菌酶-研磨复合破壁法,在研磨5min和10min后,在30kD以下的PAGE条带数少很多且清晰度差,研磨效果不如单纯氧化锆珠破壁法。对于反复冻融-研磨复合破壁法,在破壁效果及破壁时间上也没有明显的优势。因此,综合考虑成本问题、操作的简捷性以及工艺放大的可行性,单纯氧化锆珠破壁法是一种适用于乳酸菌破壁的快速、高效、经济的破壁方法。2.3氧化锆珠破壁法提取gus酶从上述革兰氏染色以及SDS结果可知,对于乳酸菌的破壁,锆珠破壁法要优于其他几种处理方法,但考虑到此法所提蛋白的活性问题,接下来又通过GUS酶活力的测定对所提蛋白的活性进行了定性检测。若以pSIP411为载体表达外源蛋白并通过锆珠破壁法提取,则GUS酶活力检测实验可在检测所提蛋白活性的同时检测外源蛋白在乳酸菌中是否表达。如图4所示,加入底物4-NPG后,诱导表达产生GUS酶的那一管(左)溶液变黄,而未诱导(右)的则不变黄,说明质粒pSIP411在菌株L.plantarum1.557中正常表达了GUS酶,且经氧化锆珠研磨提取后仍具有酶活性。说明此方法在蛋白提取过程中未破坏蛋白活性。2.4其他代谢产物菌壁破碎后,不仅可以释放出内源性蛋白,同样也可以释放出核酸以及其他代谢产物。以RNA的提取为例,RNA容易降解,所以提取要迅速。图5中可看出,菌株经锆珠研磨5min后,即可提出较高浓度的RNA,且该法所提取的RNA的OD3反复冻融法与其他破壁方法的叠加细胞破壁的方法很多,需要根据细胞的结构和化学组成选择合适的破壁方法。乳酸菌属于革兰氏阳性菌,细胞壁具有很厚的肽聚糖成分,破壁较为困难。溶菌酶可以通过分解肽聚糖中的β-1,4-葡萄糖苷键来破坏菌壁,甘氨酸可以通过取代肽聚糖中N-乙酰胞壁酸短肽上的L-丙氨酸和D-丙氨酸来破坏菌壁实验过程中发现上述5种方法对于乳酸菌的破壁均具有一定程度的破坏作用,但一些具有明显的局限性。甘氨酸破壁法不能达到