小学期9七年制基因组王丽华

实验安排1、上午：基因组DNA的提取2、中午：酶切3、下午：琼脂糖凝胶电泳鉴定移液器生物化学实验微量分析1、根据取样量，选择合适量程的加样器。2、如何调节？顺时针调节---读数变小逆时针调节---读数变大注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。（1）吸头的安装要紧密。（2）打到第一挡，将吸头插入液面下适当深度，缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（3）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，加样器推到第二挡。将液体匀速打到目的容器内，观察吸头内液体是否完全打出。加样器的使用台式高速离心机centrifugation生物化学实验离心1、打开电源。2、盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。3、标记，配平,对称放入离心机(管的连接处朝外).4、设定离心的转速和时间5、统一离心。生物化学实验

废液废头污染废物污物处理

实验步骤第一部分：裂解细胞膜、提取白细胞核第二部分:裂解核膜，释放基因组。第三部分：去蛋白第四部分：乙醇沉淀DNA第五部分：酶切，DNA电泳操作(标管号)1抗凝血--0.3ml

。2STMT--1ml，充分颠倒混匀（酒红色）。310,000×g离心2min，弃上清，倒置于滤纸。4生理盐水--0.4ml,

混匀,10,000×g离心2min,弃上清。5

NE溶液--450μl

悬浮沉淀。610%SDS--50μl

迅速混匀，蛋白酶K--50μl，轻轻摇匀，水浴1h（50℃）。7

TE饱合酚--500μl，轻摇2min，

10,000×g离心1min，上层水相移至另一Ep管（用100μl枪×？次）全取。8酚－氯仿－异戊醇（25:24:1）500μl，轻摇1min，

10,000×g离心1min，上层水相移至另一Ep管（用100μl枪×？次）全取。9

氯仿－异戊醇（24:1）500μl，轻摇1min，10,000×g离心1min，上层水相移至另一Ep管内(用100μl枪×？次)计量。10

NaAc--v，混匀（离心机甩下）。11

无水乙醇

--

2倍v，混匀，－70℃15min。操作步骤1011210,000×g离心5min，弃上清。13

滤纸条吸残液，室温干燥10min。操作步骤15DNA液--8μl，EcoRⅠ

--1μl(提供内切酶反应最适条件)10×TE缓冲液--1μl37℃水浴60min14

加双蒸水--20μl，溶解沉淀8μl：酶切12μl：电泳对照真核细胞DNA的分离提取及酶切电泳实验十八第一部分DNA的分离提取第二部分电泳检测掌握人外周血基因组DNA的提取原则和方法实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法(Genome)样品：人外周血白细胞核中DNA基因组DNA1步抗凝血2步STMT溶液3步离心，弃上清，倒置于滤纸4步生理盐水混匀,离心,弃上清操作原理-1一、裂解细胞膜提取细胞核二、裂解细胞核膜释放基因组（准备保护DNA）5步

NE溶液NaCl（高浓度Na+）EDTA抑制DNase操作原理-2破坏核膜6步SDS溶液三、DNA与蛋白质解离6步蛋白酶K：消化组蛋白（除去残存的酚及蛋白）离心，取上层水相移至另一Ep管；（用100μl枪×？次）全取计量。7步

TE饱合重蒸酚8步酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）9步氯仿－异戊醇（24:1）四、DNA的纯化

去除蛋白等乙醇+盐五、DNA的浓缩沉淀法

10步

NaAc--v，混匀（离心机甩下）10111步

无水乙醇

--

2倍v，混匀，－70℃15min。（低温利于沉淀）12步离心，弃上清13步滤纸条吸残液，室温干燥降低DNA的溶解度，稳定DNA分子核酸分离提取的总原则完整性的保证1简化操作步骤，缩短提取过程2减少化学因素对核酸的降解（pH4～10）（减少破坏因素）3减少物理因素对核酸的降解4防止核酸的生物降解机械剪切力：高速震荡；快速狭长孔道；反复冻溶…高温：常规操作温度为0～４℃核酸分离提取的总原则纯度的保证

1其它生物大分子的污染应降到最低程度2排除其它核酸分子的污染3不应存在对核酸有影响的有机溶剂和金属离子（蛋白质，多糖和脂类等）（如提DNA时，应去除RNA分子，反之亦然）

第二部分基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测准备工作一、铺胶1.封口2.溶胶3.加入溴乙啶4.插入样品梳5.灌胶缓慢连续，不要形成气泡151％琼脂糖凝胶电泳检测：（1）电泳装置及胶板（一套）

（2）样品操作步骤①载样液--2μl+酶解液10μl，混匀（统一加入，离心机甩下）②

取样--10μl

（各组分别取样，依次加样，墙侧为1组）甘油：样品下沉溴酚蓝：示踪指示剂（3）电泳检测：100V30-40分钟DNA液12μl载样液3μl线性DNA片段（kb）琼脂糖浓度（%）

5–600.40.8–100.7

0.4–6

1.00.2–41.50.2–31.750.1–32.0

第二部分基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测原理用荧光嵌入染料溴化乙啶染色,紫外光下检出。

不同浓度琼脂糖凝胶可分离不同长度的DNA片段。(agarosegelelectrophoresis)线状双链DNA分子迁移率与碱基对数目对数值成反比（1）琼脂糖浓度：（2）DNA的分子大小：（3）DNA的