三细胞生物学研究方法2

2023/9/21第三章细胞生物学研究方法

第一节细胞形态结构的观察方法

第二节细胞及其组分的分析方法第三节细胞培养与细胞工程

第四节

细胞及生物大分子的动态变化第五节模式生物与功能基因组的研究第1页/共35页2023/9/22第一节细胞形态结构的观察方法工欲善其事，必先利其器。显微镜之于生物学，犹如望远镜之于天文学。第2页/共35页2023/9/231.1光学显微镜提高分辨率的手段有缩短光线波长，应用特殊的光学效应，增强反差。最短的可见光波长是450nm，此时分辨率约为0.3um，若在油镜下，N可提高到1.5，分辨率可达到0.2um。这个数值就是显微水平和亚显微水平的分界线。第3页/共35页两束光波之间的相互干涉2023/9/24第4页/共35页2023/9/25不同显微镜下观察体外培养的成纤维细胞A、普通光学显微镜B、相差显微镜C、微分干涉显微镜增强样品的反差，实现了对非染色活细胞的观察第5页/共35页2023/9/26荧光显微镜技术细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。目前，荧光显微镜得到了广泛的应用，特别是细胞内动态的研究。第6页/共35页2023/9/27荧光蛋白日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健获得2008年诺贝尔化学奖。下村修是首位从水母中分离绿色荧光蛋白的科学家，他发现这种蛋白在紫外线光中呈现亮色。马丁-查尔菲展示了绿色荧光蛋白作为各种生物现象的亮光基因标签的价值。钱永健对我们理解绿色荧光蛋白如何发光作出了贡献，他还将颜色标签扩展至除绿色之外的颜色，以便可以用各种颜色标识不同的蛋白和细胞。第7页/共35页2023/9/281.2电子显微镜电镜采用波长比可见光短得多的电子束作为光源。电子束的波长只有0.01-0.9nm，分辨率可达0.2nm，是光镜的1000倍。电镜和光镜在基本原理上完全不同，但光路图十分相近。染色方法不同，光镜用染料，而电镜用重金属盐，所以电镜不能观察活的细胞结构。缺点：不能观察活的生物样品第8页/共35页2023/9/29第9页/共35页2023/9/210电镜与光镜比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm0.2nm可见光（400-700）电子束（0.01-0.9）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差，图像需要用荧光屏显示或者感光胶片作记录。第10页/共35页2023/9/211电镜超薄样本制备示意图第11页/共35页冷冻蚀刻技术冷冻断裂和蚀刻复型不需要包埋和固定2023/9/212第12页/共35页扫描电镜技术电子探针激发样品表面（喷镀金膜）放出二次电子，转变成光信号，得到样品表面的立体图像信息。2023/9/213第13页/共35页2023/9/214高尔基体透射电镜图（伪彩色）既然有了电子显微镜，还需要光学显微镜吗？？第14页/共35页2023/9/2151.3扫描隧道显微镜根据隧道效应而设计，是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器。分辨率能达到0.1nm(原子尺度)，非破坏性测量，纳米生物学。1986年诺贝尔物理学奖类似的还有原子力显微镜第15页/共35页小结光镜、分辨率光镜的发展：相差显微镜、荧光显微镜电镜：原理、制片、扫描电镜、冷冻蚀刻技术扫描隧道显微镜2023/9/216第16页/共35页单词electronmicroscope,fluorescencemicroscope.2023/9/217第17页/共35页2023/9/218第三章细胞生物学研究方法

第一节细胞形态结构的观察方法

第二节细胞及其组分的分析方法第三节细胞培养与细胞工程

第四节

细胞及生物大分子的动态变化第五节模式生物与功能基因组的研究第18页/共35页2023/9/219细胞组分的分离

差速离心：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器第19页/共35页2023/9/220密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。第20页/共35页2023/9/221细胞内核酸、蛋白质、糖和脂类的显示方法原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。第21页/共35页2023/9/2221.金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀2.偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。3.Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。4.联苯胺反应5.普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。6.Formazane反应：显示脱氢酶。7.“Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。8.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。9.茚三酮反应：显示蛋白质。第22页/共35页2023/9/223特异蛋白和特异核酸的定性和定位特异蛋白抗原的定位与定性

主要是免疫反应特异核酸的定位与定性

分子杂交技术荧光显微镜电子显微镜第23页/共35页2023/9/224利用免疫反应对特异蛋白抗原的定位与定性免疫电镜技术免疫荧光技术第24页/共35页2023/9/225放射自显影技术研究生物大分子的合成动态

原理及应用：

利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含卤化银）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；特征是可以实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。操作：见书P68和图3-22第25页/共35页2023/9/226定量细胞化学分析技术流式细胞仪第26页/共35页2023/9/227显微光谱分析技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。第27页/共35页2023/9/228第三章细胞生物学研究方法

第一节细胞形态结构的观察方法

第二节细胞组分的分析方法

第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术

第四节用于细胞生物学研究的模式生物第28页/共35页2023/9/229植物细胞和动物细胞的培养

动物细胞培养

类型：原代培养细胞（primaryculturecell） 传代培养细胞（sub-culturecell）

细胞系（cellline）

永生细胞系，如Hela细胞系

植物细胞 原生质体培养（体细胞培养）

类型：单倍体细胞培养（花药培养）

非细胞体系（cell-freesystem）

第29页/共35页2023/9/230细胞工程

细胞融合与细胞杂交技术

单克隆抗体技术（1984年诺贝尔奖）

细胞拆合与显微操作技术第30页/共35页2023/9/231显微操作第31页/共35页2023/9/232第三章细胞生物学研究方法

第一节细胞形态结构的观察方法

第二节细胞组分的分析方法

第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术

第四节用于细胞生物学研究的模式生物第32页/共35页2023/9/233不同物种享有共