中国药典微生物限记录

2015版《中国药典》微生物学检验技术实施指导与修订解读内容简介一、2015年版《中国药典》微生物学检验的发展和修订二、非无菌产品微生物检查：微生物计数法

.修订依据

.格式变化

.适用范围④.环境要求⑤.微生物技术方法的修订内容（a.方法适用性试验修订b.试验方法的修订c.培养基体系的修订）三、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法四、《2015版药典》制药用水检查法修订内容五、微生物检验超标结果（OOS）情况的调查和处理六、2015版《中国药典》无菌检查法七、生物安全实验室要素一、2015年版中国药典微生物学检验的发展和修订ICH：人用药物注册技术国际协调会协调各国对药品注册所需的质量、安全性和疗效的技术要求建立统一规范的质量技术要求，减少国际间贸易的障碍。PDG：药典讨论组1989年，由欧洲药品质量管理局、美国药典委员会和日本药局方的三方代表组成了PDG。(一）修订后微生物限度检查法的特点修订后的微生物限度检查法概念更明确、体例更合理修订前：一个通则：微生物限度检查法修订后：三个通则：非无菌产品微生物检查：微生物计数法非无菌产品微生物检查：控制菌检查法非无菌药品微生物限度标准修订后的特点概念明确，体例合理与国际接轨，兼顾了国情1.试验环境的要求2.菌种采用CMCC3.检验量依照《中国药典》2010年版，主要工艺剂型限制4.微生物限度标准5.控制菌检查：保留部分生化试验6.修订后，控制指标更合理，计数方法及标准合理、准确，反映真实污染情况2015版药典微生物检查法修订内容——环境要求目前我国药品微生物检测对环境的要求与国际标准分级不一致。国际要求：只要洁净环境分为A级、B级、C级、D级。A（百级）、B（千级）、C（万级）、D（十万级）。协调案要求：试验在经过设计的可避免外来微生物污染供试品的环境下进行。我国修订后药品微生物限度检查对检测环境的要求：无菌环境下符合微生物技术检验要求，单向流空气区域内进行。（二）2015版药典微生物检查法修订内容——环境要求1.强调了“微生物实验的各项工作应在专属的区域进行，以降低交叉污染、假阳性结果和假阴性结果的风险”。2.无菌检查修订前万级（C级）下局部百级（A）或隔离器修订后B+A级或建议D级背景下隔离器3.微生物限度检查修订前万级（C）下局部百级（A)修订后不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。2015版药典微生物检查法修订内容——环境要求既要最大可能防止微生物污染，又要防止检验过程对环境和人员造成伤害。活动区域的合理规划及区分将提高微生物实验室操作的可靠性。洁净环境检测修订前单向流空间区域。工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行检测。（三）2015版药典微生物检查法修订内容——计数法修订前细菌数——营养琼脂霉菌及酵母菌数——玫瑰红钠琼脂修订后需氧菌总数——胰酪大豆胨琼脂（TSA）霉菌及酵母菌总数——沙式葡萄糖琼脂（TSB）2015版药典微生物检查法修订内容——控制菌检查法修订前大肠菌群、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌修订后耐胆盐革兰氏阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌2015版药典微生物检查法修订内容——结果判断微生物计数法和控制菌检查法结果判断不再规定复试，通过实验室调查、回顾、分析结果的准确性。限度标准以指数方式表示：10的一次方cfu：可接受的最大限度为20；10的二次方cfu，可接受的最大限度为200；以此类推。2015版药典通则非无菌产品微生物限度标准增订内容1.除中药、化学药和生物制品的限度标准外，增订了原料、敷料、中药提取物及饮片的微生物限度标准。2.菌数计数结果以10的n次方表示。3.以需氧菌总数取代细菌数，以耐胆盐革兰阴性菌取代大肠菌群。微生物限度标准解释菌数限度标准以10的n次方表示1.不应理解为限速标准是放宽，而是因微生物计数不同于化学成分的定量测定，微生物在供试液中的分布及取样时的不均匀性都将带来结果的不准确性，这关系到微生物计数实验结果的精密度。2.药品微生物限度标准中，药用原料、辅料及中药提取物仅规定检查需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。因此，在制定其微生物限度标准时，应根据原辅料的微生物污染特性、用途、相应制剂的生产工艺及特性等因素，还应控制具有潜在危害的致病菌。2015版药典抑菌效力检查法修订内容抑菌剂：是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂。1.抑菌效力检查法系用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性，以评价最终产品的抑菌效力。2.用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖是药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。3.抑菌剂不能替代药品生产的GMP管理，不能作为非无菌制剂降低微生物污染的唯一途径。4.所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。修订内容1.培养基、培养基适用性检查、检查方法所用菌种名称、菌液制备均与非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中一致。2.方法的适用性试验中各试验菌的回收率：平均数不少于对照培养基上菌落平均数的70%，且菌落形态、大小与对照培养基上的一致，判该培养基的适用性检查符合规定。3.结果判断中的初始值定为所加菌数值。二、《中国药典》非无菌产品微生物检查：微生物计数法微生物计数供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法;1.应选择操作简便、快速的方法。2.应避免损伤污染的微生物。3.抑制作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应选薄膜过滤法。试验菌液的制备和使用

应来自认可的国内外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。

试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）保藏方法冷冻保藏——长期储藏方法，一般在低于-30℃或-70℃冰箱内保藏，需要加入保护剂，如：甘油。冻干法保藏——长期保藏法，例如冻干菌种。冷藏——短期储藏法，在2—8℃的冰箱保藏。新鲜培养物制备用培养基修订前营养琼脂培养基营养肉汤培养基改良马丁琼脂培养基改良马丁培养基修订后胰酪大豆胨琼脂（TSA)胰酪大豆胨肉汤培养基(TSB)沙式葡萄糖琼脂(SDA)沙式葡萄糖肉汤培养基(SDB)菌液制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨琼脂、胰酪大豆胨肉汤30—35℃培养18—24h白色念珠菌沙式葡萄糖琼脂、沙式葡萄糖液体培养20—25℃培养2-3天黑曲霉沙式葡萄糖琼脂20—25℃培养5-7天，或直到获得丰富的孢子。稀释液0.9%氯化钠溶液PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液培养基修订前细菌计数：营养琼脂霉菌和酵母菌计数：玫瑰红钠琼脂酵母菌计数：酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂试验菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉修订后需氧菌总数测定：胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤霉菌和酵母菌总数测定：沙式葡萄糖琼脂试验菌株：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉修订前适用于固体培养基，加菌量50-100cfu营养琼脂、营养肉汤30-35℃，48h玫瑰红钠琼脂23-28℃，真菌72h修订后适用于液体、固体培养基，加菌量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂、胰酪大豆胨肉汤、沙式葡萄糖琼脂20-25℃，好氧菌不超过3天，真菌不超过5天。

固体培养基：与对照培养基比较，菌数比值在0.5-2（50%-200%)范围。液体培养基：生长良好。

计数方法的增修订内容修订前1.平皿法：倾注法2.薄膜过滤法修订后1.平皿法：（1）倾注法（2）涂布法：接种约0.1-0.2ml供试液，涂布均匀，培养。2.薄膜过滤法3.最大可能数法（MPN）以细菌在胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中生长后的浊度比较做判断，精确度较差，仅适用于无适宜方法时的需氧菌总数计数，不适于霉菌计数。微生物技术方法倾注法取供试液1ml，置直径90mm的无菌平板中，注入15-20ml温度不超过45℃熔化的培养基，混匀，凝固，倒置培养。涂布法取15-20ml温度不超过45℃的培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板。接种量不少于0.1ml。使用范围：适宜好氧菌培养。注：1.操作较繁琐，增加污染几率，计数不准确（涂布棒会沾少许微生物）2.一次只可加0.1-0.2ml样品。薄膜过滤法1.孔径应不大于0.45微米。直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。2.滤膜材质应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器注意点1.滤器及滤膜在使用前应采用适宜的方法灭菌。2.使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。3.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。4.油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。5.供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。三、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法

控制菌检查项目

培养基体系

培养基适用性检查

检查方法适用性试验检验项目修订前大肠杆菌、大肠菌群、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌修订后大肠杆菌、耐胆盐革兰氏阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌培养基的配制使用容器配制培养基使用的容器应该是玻璃器皿或搪瓷器皿等。禁用金属容器如：铁、铜、铝容器。培养基制备方法实验室指南溶解培养基应当用水浴加热进行溶解。测定pH值矫正pH，配制培养基必须矫正pH,并进行验证。培养基灭菌后冷却至室温（25℃）进行pH测试。培养基pH范围不得超过规定的正负0.2。<高压灭菌前的pH值应比最终pH值高0.2左右>培养基的储藏琼脂培养基不得在0℃或0℃以下存放，防止冷冻破坏凝胶特性。琼脂培养基最好现用现配，如置冰箱保存，一般不超过一周，且应密闭包装，若延长保存需经验证确定。培养基灭菌后应立即取出，不得储存在高压灭菌器中。培养基适用性试验修订内容控制菌检查用培养基数量减少7个，在增菌过程中，使用无选择性增菌培养基。理由：污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损伤，使用无选择性增菌培养基培养，使受损伤的细胞得到修复，提高检出率。培养基适用性检查成品培养基、脱水培养基或按处方配制的培养基的适用性检查促生长能力、抑制能力和指示特性的检查。实验菌株的管理使用及鉴定菌种的保藏低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此，低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。菌液制备用培养基菌株培养基培养温度（℃）培养时间（h）枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌黑曲霉胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤。沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤沙氏葡萄糖琼脂30-3520-2520-2518-24h2-3天5-7天，或直到获得丰富的孢子革兰染色方法涂片—干燥—固定—初染—媒染—脱色—复染—冲洗—滤纸—干燥—显微镜观察注：1.涂片以匀薄为佳，涂太厚影响镜检结果。2.复染：滴加番红染液30s—1min。水洗，待干。番红复染，增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌。白色念珠菌菌落形态：球形，表面光滑，呈乳白色。显微镜下形态：革兰阳性菌，有厚膜孢子，假菌丝、芽管，孢子长出短小芽管。金黄色葡萄球菌菌落形态：圆形凸起，呈金黄色，边缘整齐，周围有黄色环，表面光滑湿润。革兰染色：紫色，革兰氏阳性菌。显微镜下形态：呈圆形，葡萄状排列，无芽孢、无鞭毛。四、《2015版药典》制药用水检查法修订内容定义制药用水是药物生产用量大，使用广的一种辅料，用于生产过程及药物制剂的制备。分类根据使用的范围不同，分为饮用水、纯化水、注射用水及灭菌注射用水。制药用水的原水通常为饮用水。纯化水质量标准修订适用性试验试验菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌试验方法照通则1105中计数培养基适用性检查法，同胰酪胨大豆琼脂培养基纯化水质量标准修订修订前取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查，细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不超过100个。修订后取本品不少于1ml,按薄膜过滤法处理后，采用R2A琼脂培养基，30—35℃培养不少于5天，依法检查，需氧菌总数每1ml供试品中不得过100cfu。制药用水的质量控制1.制水系统应经过验证，并建立日常监控、检测和报告制度，有完善的原始记录备查。2.制药用水系统应定期进行清洗与消毒，消毒可以采取热处理和化学处理等方法。3.采用的消毒方法以及化学处理后消毒剂的去除应经过验证。五、微生物检验结果超标情况的调查1.定义OOS：属于偏差，是一种影响产品最终质量的偏差。2.微生物检验结果超标的调查微生物检验涉及的环节较多、污染呈不均匀状态，不易查出确切的污染环节。需根据具体情况将重新取样（同一批号）进行复检并对检验结果分析判断。微生物检验结果超标的调查如需再检验，应遵循以下要求1.按药典规定进行复检。2.控制菌检验结果不合格，不再复检，以一次检验结果报告。3.限度检查项不合格，可进行复检以三次检验的平均值报告。4.细菌、酵母菌选取菌落数小于300cfu，霉菌宜选取平均数小于100cfu的稀释级作为菌数报告的依据。六、2015版《中国药典》无菌检查法无菌检查的有关概念1.无菌——是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。2.无菌操作——是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。3.无菌技术——是指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌实验器材及无菌操作。4.无菌环境——是用物理或化学的方法以某一可控的空间内使悬浮粒子、浮游菌数量降到最低限度，接近于“无菌”的一种空间。洁净室/区、净化工作台、隔离系统等就是按该设计要求创建的空间。5.无菌药品——指法定药品标准中列入无菌检查项目的制剂和原料药，包括无菌制剂和无菌原料药。6.无菌检查的性质——是一种有关药品安全的定性试验。是根据试验的培养基中是否有微生物生长来判断结果（液体培养基变浑浊一般表明样品受到微生物的污染）七、生物安全实验室要素1.实验室生物安全屏障