利用氯化苄提取真菌基因组dna的研究

利用氯化苄提取真菌基因组dna的研究

关于提取细菌血浆蛋白的方法，报道了几种方法。真菌细胞壁中主要以几丁质构成其骨架结构,而几丁质是以N-乙酰基葡萄糖胺为单体的聚合物,它的糖链上有大量的羟基。氯化苄(PhCHOH+PhCH本研究利用氯化苄提取无花果曲霉等4种真菌的基因组DNA,旨在寻找一种操作方便、快速、满足分子生物学研究要求的DNA提取方法,为进一步开展真菌的分子生物学研究奠定基础。1材料和方法1.11.1.1设备pcr1.1.2蘑菇(1.1.3试剂PhCH1.21.2.1溶液和培养基的制备(1)500mmol-ltri-hclph9.080mL(2)500毫米和晶体ph8.080mL(3)10%？sdsph7.290mL(4)3mol/lnaacph5.280mL(5)t保-hcl(100mmol/LTris-HCl,pH9.0;40mmol/LEDTA,pH8.0):(6)TE80mL(7)“三自”结构的应用50(8)6，六90mL(9)1mg？毫升b0.1g(10)方面,提出了以《法国民法典》第20g为代表的新的诉求,把《g》打造成g200g,1.2.2培养与细菌体的收集(1)“三自”结构的应用4(2)“三自”结构的应用21.2.3用液体氮研磨制备的细菌粉末。1.2.4提取各组dna1.5mL1.2.5nase解散DNA1.2.6dna电泳(1)称取0.4g电泳级琼脂糖加入50mL1(2)在10μLDNA样品中加3μL6(3)100V电压下电泳30min。(4)紫外灯下观察,拍照。1.2.7在花瓶as3.滁州中使用TaKaRaLATaq(RR002ACA)试剂盒,采用50μL扩增体系:5μL102结果与讨论2.1总dna的分离和测序从1.2.1中收集的菌体不经破碎,直接按照1.2.3的方法提取DNA,当加入无水乙醇后,Ra01和Rc01管内有絮状沉淀出现,0.8%琼脂糖凝胶电泳在23kb处出现均一的DNA亮带,无降解;在点样孔内无荧光亮点产生,说明所提DNA样品中几乎没有蛋白杂质;在DNA亮带前方有弥散亮带为RNA。2.2as3.4和tf063-4基因组dna的获得AS3.324和Tf01按照上述方法不能提取其基因组DNA。这是因为这两种菌的破壁程度不够。为了提高菌体的破碎度,采用液氮研磨与氯化苄作用相结合的方法进行提取:先用液氮研磨制备菌粉(方法见1.2.2),然后按照方法1.2.3用氯化苄从两种菌的菌粉中提取DNA。0.8%琼脂糖凝胶电泳上23Kb处出现均一的DNA亮带,AS3.324基因组DNA的电泳结果如图1所示。1为分子量标记λ-HindIII,2-5为AS3.324基因组DNA。成功提取AS3.324和Tf01基因组DNA的原因在于液氮研磨大大增加了氯化苄与菌体的接触面积,使得氯化苄可以更完全地破坏菌体细胞壁,在SDS的作用下成功地提取出两株菌的基因组DNA。所提DNA无降解,在点样孔内无荧光亮点产生,说明所提DNA样品中几乎没有蛋白杂质;在DNA亮带前方有弥散亮带为RNA。氯化苄法提取基因组DNA的关键就是氯化苄与菌体细胞壁完全作用以破坏细胞壁,而氯化苄与菌体的充分接触是破壁反应顺利进行的必要条件,对于DNA的产量和质量均有重要影响。在实验过程中,需要在加入SDS和氯化苄之前,先加提取液,振荡使之与菌体充分混合;加入SDS和氯化苄后,剧烈振荡使管内混合物成乳状;以及在保温过程中每隔10min温和振荡混合一次这些措施也都是为了使氯化苄与菌体细胞壁充分作用。2.3破壁反应的最适ph提取液的pH值对提取结果十分重要。因为氯化苄需要在碱性条件下与多糖上的羟基作用来进行破壁反应,所以本研究中分别在以下4个pH值条件下对AS3.324进行了提取实验,以确定破壁反应的最适pH条件:pH8.0、pH9.0、pH10.0和pH11.0。电泳结果表明:在pH9.0条件下所提取的DNA一级结构最完整,产量最大。pH8.0时所提DNA产量很小;pH10.0时得到的DNA降解严重;而当pH值上升至11时,没有得到任何DNA亮带。由此确定了破壁反应的最适pH条件为弱碱性条件pH9.0。pH值太低时,氯化苄破壁反应会受到抑制,从而导致破壁作用进行得不完全,DNA得率低;pH值太高时,又会导致DNA变性和降解,从而得不到DNA产物。2.4dna的生物学分析以所提无花果曲霉(AS3.324)的基因组DNA为模板进行分子生物学分析。2.4.1rna的消解以所提DNA为模板进行PCR扩增时,需对其中的RNA进行消解,为考察有无氯化苄残留及对氯化苄提取方法对RNA消解的影响,按照方法1.2.4做RNA消解实验。电泳结果如图2所示:DNA亮带前方RNA的弥散亮带完全消失而对DNA没有任何影响,说明样品中无氯化苄残留,此方法不影响RNA的消解。1为分子量标记λ-HindIII,2-5为AS3.324基因组DNA。2.4.2pcr扩增氯化苄以所提AS3.324基因组DNA为模板,按方法1.2.6通过PCR扩增其phyA基因以检验所提DNA的质量,结果如图3所示:在1.0%琼脂糖凝胶电泳上1.4kb处出现了均一的DNA亮带,没有非特异性扩增产物生成。扩增得到的phyA已被成功地克隆至载体pMD-18T中(另文报道)。氯化苄对后续的分子生物学操作无不良影响。1,10分子量标记DL2000,2-5AS3.324phyA基因(使用TaKaRaProbestTaqDNA聚合酶),6-9AS3.324phyA基因(使用TaKaRaLATaqDNA聚合酶)。2.5乙醇沉淀dna的制备由于氯化苄的极性与苯酚相近,因此也具有抽提蛋白质的作用,为考察氯化苄对蛋白质的抽提效果,在用无水乙醇沉淀DNA之前先在所得上清液中加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀后于10000转室温离心15min,将上层水相移入另一离心管中。结果表明:离心后在有机溶剂相与水相的界面处没有沉淀出现,说明氯化苄已将DNA样品中的蛋白质在保温过程中抽提出去,因此所提DNA中没有蛋白杂质。3氯化苄法提取基因组dna本研究用氯化苄提取无花果曲霉(AS3.324)等4种真菌的基因组DNA,得出以下几点结论:(1)利用氯化苄从中华根霉Rc01和少根根霉Ra01的完整细胞中提取了其基因组DNA,大小均在23kb以上,无降解,无蛋白污染。(2)利用氯化苄从无花果曲霉AS3.324和无花果丝孢酵母Tf01经液氮研磨制备的菌粉中提取了其基因组DNA,大小均在23kb以上,无降解,无蛋白污染。(3)确定了利用氯化苄提取基因组DNA的最适pH作用条件为pH9.0。(4)利用氯化苄提取的DNA样品可省略蛋白质抽提过程,破壁抽提合二为一。(5)确定了保证氯化苄与菌体充分接触的实验措施:[i]在加入SDS和氯化苄之前,先加提取液,振荡使之与菌体充分混合;[ii]加入SDS和氯化苄后,剧烈振荡使管内混合物成乳状;[iii]在保温过程中每隔10min温和振