3种不同类型叶片色素提取工艺的比较

3种不同类型叶片色素提取工艺的比较

高等植物叶片的色素组成主要包括叶子和类胡同。绿叶主要分为绿叶a和叶色b，类胡同主要分为胡萝卜和黄鼠尾草。叶绿素是植物进行光合作用的重要成分,也是反映植物生理状况的重要指标本研究综合以上测定方法的优缺点,旨在建立一种高效快速测定植物叶片色素的方法,简称液氮法,即使用液氮对植物叶片进行快速冷却,使用钢珠或研钵迅速粉碎植物叶片组织,再使用溶剂进行提取。该法对角质层薄、细胞排列松散的叶片组织色素提取可以做到完全避光,防止色素降解;对角质层较厚、细胞排列紧密的叶片,也可有效提高色素提取效率。使用该法筛选不同类型叶片色素提取的最佳溶剂、温度和时间及确定叶片与溶剂的最佳质量体积比,即可精确快速测定不同类型叶片组织中的色素含量。1材料和方法1.1种叶片类型中华蚊母树(Distyliumchinense(Fr.)Diels)、栀子树(GardeniajasminoidesEllis)和油麦菜(Lactucasativavarlongifoliaf.Lam)的叶片分别作为典型的角质层厚、细胞排列紧密(叶片硬厚),角质层中等、细胞排列较紧密(叶片较厚)和角质层薄、细胞排列松散(叶片软薄)的3种叶片类型,用于不同结构叶片的色素提取效率研究。中华蚊母树叶片采自华中药用植物园,栀子树叶片采自湖北省农业科学院中药材研究所,油麦菜叶片购自恩施市菜市场,均于2018年4月10日完成采摘或购买。选用颜色均一、去除叶脉的成熟叶片,使用前充分剪碎、混匀,每个处理设置3个重复。1.2方法1.2.1叶片横截面结构采用卡宝品红染色法1.2.2提取剂为单一溶剂法分别采用液氮法、研磨法和浸提法3种方式对3种不同类型叶片中的色素进行提取,筛选不同类型叶片色素的最佳提取方法。液氮法(MLN):称取0.1g叶片(角质层薄、细胞排列松散)到装有钢珠的10mL离心管中,倒入液氮,在液氮刚好挥发完时盖上离心管盖置于涡旋仪上涡旋,重复以上操作直至叶片充分粉碎,用锡箔纸裹住离心管,加入8mL提取溶剂,4℃避光提取10min;或称取0.1g叶片(角质层较厚、细胞排列紧密)加入到事先预冷(4℃)的研钵中,倒入少许液氮进行充分研磨,使用8mL提取溶剂分4次将研磨液转移至10mL离心管中,4℃避光提取10min;液氮法提取色素的过程中反复颠倒离心管3～5次。研磨法(MG):称取0.1g叶片到研钵中,加入少许石英砂充分研磨,使用8mL提取溶剂进行洗转,常温(25℃)下避光提取30min。浸提法(ME):将叶片充分剪碎,称取0.1g叶片到离心管中,加入8mL提取溶剂,常温避光提取24h。1.2.3体积比1分别使用8种有机提取溶剂对不同类型植物叶片的色素进行提取。8种溶剂为A:φ=80%丙酮;B:φ=95%乙醇;C:丙酮∶乙醇=1∶1(体积比);D∶丙酮∶乙醇=2∶1(体积比);E:丙酮∶乙醇=1∶2(体积比);F:丙酮∶乙醇∶水=6∶3∶1(体积比);G:丙酮∶乙醇∶水=3∶6∶1(体积比);H:丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1(体积比)。称取0.1g3种不同类型的植物叶片,统一采用液氮法对叶片进行处理,分别使用8种溶剂,4℃避光提取10min后测定各色素质量分数。1.2.4单次给药时间和光照度研究不同温度、光照条件及提取时间对不同类型植物叶片色素提取的影响。温度分别设置-20、4、25和37℃4个梯度,光照度设置0、100、1000lx3个梯度,提取时间设置1、3、5、10、20、30、60min7个梯度。溶剂统一使用φ=80%丙酮,分别提取3种不同类型叶片的色素。1.3对类黄酮和类黄酮的测定赵先明等1.4处理数据利用Excel2007、SPSS19.0进行数据处理和统计分析,使用origin8.1作图。2结果与分析2.13栀子树叶片组织结构从图1可以看出,中华蚊母树的叶片角质层厚、细胞排列紧密(图1-A);栀子树的叶片角质层中等、细胞排列较紧密(图1-B);油麦菜叶片的角质层薄、细胞排列松散、无规则(图1-C)。2.2提取方法是最佳由表1可知,液氮法提取的中华蚊母树叶片中的叶绿素a质量分数显著高于其他提取方法(P<0.05),达到0.55mg·g2.3乙醇的叶绿素a和类胡萝卜素a对叶绿素a和类胡萝卜素a比例的影响如图2,中华蚊母树叶片的最佳提取溶剂为丙酮∶乙醇:水=4.5∶4.5∶1的混合溶液(图2-A),叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的质量分数分别为0.55、0.17和0.21mg·g2.4各色素提取量的比较表2显示,3种不同类型叶片色素的最佳提取温度均为4℃。当温度为-20～4℃时,随着温度升高,色素提取效率逐渐增加;当温度为4～37℃时,随着温度升高,色素提取效率逐渐降低,说明温度过低或过高都会影响叶片中各色素的溶出效率。从表3可得,随着光照强度的增加,3种不同类型叶片中的色素提取量逐渐降低。黑暗条件下各色素的提取效果最好,叶绿素a和类胡萝卜素质量分数显著高于1000lx光照度处理(P<0.05),不同光照度处理下叶绿素b的提取效率差异不显著(P>0.05)。从图3可以看出,随着浸提时间的延长,不同类型叶片中各色素的提取量逐渐增加。中华蚊母树叶片和栀子树叶片研磨提取10min后色素提取量达到最大,随后基本保持不变;油麦菜叶片浸提5min后提取量达到最大,叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的质量分数分别为1.25、0.40和0.57mg·g2.5质量体积比对各提取色素的影响从图4可以看出,3种不同类型的叶片质量与提取溶剂的比例为1∶100时,叶片中的各色素提取量最大。当叶片与溶剂的质量体积比大于1∶100时,各色素的提取量随质量体积比减小而增加;而当叶片与溶剂质量体积比小于1∶100时,色素的提取量随质量体积比减小而减小,并在1∶400时最低。叶片与溶剂的质量体积比为1∶200～1∶50时各色素提取量无显著性差异(P>0.05),是浸提3种不同类型叶片色素较为理想的范围。3最佳提取溶剂本研究中3种不同类型叶片的横切面结构显示,中华蚊母树叶片的角质层最厚,且细胞排列紧密;栀子树叶片的角质层厚度次之,细胞排列较紧密;油麦菜叶片的角质层最薄,细胞排列松散、无规则;因此以上3种植物叶片可作为色素提取效率研究的良好材料。植物组织中色素的提取方式不同,色素的提取效果也不一样本研究中中华蚊母树叶片和栀子树叶片的最佳提取溶剂均为丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1的混合溶剂,这与张秀君等在提取植物组织中的色素时,提取温度、时间和叶片与溶剂的质量体积比都会影响色素的提取效果本研究采用中华蚊母树、栀子树及油麦菜的叶片作为3种不同类型的叶片代表,用于探索高效快速提取植物叶片色素的最佳方式,发现不同类型叶片色素的提取均以液氮法提取效率最高,且整个测定过程时间最短。对于角质层薄、细胞排列松散的植物叶片,色素的提取过程可完全避免光照,防止色素降解,增加色素的提取效率,同时大幅缩短提取时间。以油麦菜叶片为例,色素提取完全仅需5min。对于角质层较厚、细胞排列紧密的植物叶片,液氮气化过程能瞬间凝结叶片并降低叶片组织的温度,有利于提高研磨效率并使研磨更加充分,同时研磨过程保持在较低温度下进行,可以有效防止色素降解,以中华蚊母树和栀子树叶片为例,整个色素提取过程不超过10min。相比以往的色素提取研究,该法提取过程操作简单、耗时短、效率高、测定结果稳定,可用于科研工作和工业生产中对植物叶片色素的