环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶制备固定化金属亲和层析介质

环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶制备固定化金属亲和层析介质

1环氧氯丙烷法随着生物技术的发展，固定化金属亲和色度技术（imac）技术在蛋白质中的分离和精制（imark）。通常环氧氯丙烷活化琼脂糖都以水为反应介质,环氧氯丙烷在水中的溶解度约为6.58%左右,因此该反应是一个复杂的油(环氧氯丙烷)-水-固(凝胶)三相反应体系,反应速率较慢;同时环氧化过程中环氧基在碱性条件下极易发生水解副反应,需要对反应条件进行全面优化和严格控制才能获得较高的活化效率本工作考察了环氧氯丙烷在DMSO中对琼脂糖凝胶Sepharose6FF进行活化的反应条件,结果表明通过条件优化环氧基密度可达163μmol/mL.以IDA为螯合剂制备出了高金属离子密度的Cu2材料和方法2.1bsa、环氧氯丙烷、乙二胺四乙酸四乙酸四乙酸四乙酸四乙酸四钠dmso及unimasic琼脂糖凝胶Sepharose6FF购自瑞典GEHealthcare公司,牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA)购自美国Sigma公司,其他试剂包括二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)、环氧氯丙烷(Epichlorohydrin,ECH)及IDA、乙二胺四乙酸四钠盐(EthylenediamineTetraaceticAcid,EDTA)、五水硫酸铜、咪唑等均为分析纯,购自北京化学试剂公司.Unico2800紫外-可见分光光度计(美国Unico公司).2.2实验方法2.2.1dmso溶液的配制量取保存于20%(ϕ)乙醇水溶液中的Sepharose6FF约20mL(沉降体积),在G4沙芯漏斗中用蒸馏水反复洗涤以除去乙醇,真空抽干至无水滴滴下.向介质中依次加入20%,50%,70%(ϕ)的DMSO水溶液各40mL,搅拌清洗5min,每次清洗后用真空抽干清洗液.从处理好的琼脂糖凝胶中称取6份每份约1.0g介质加入50mL锥形瓶中,向每份介质中依次加入一定量DMSO,ECH,H2.2.2ida和cu取约15g环氧氯丙烷活化过的琼脂糖凝胶,加入50mL含1.0mol/LIDA,2.0mol/LNaCu2.2.3imac介质对bsa的吸附和洗脱BSA在IMAC介质上的吸附平衡实验在含0.5mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸缓冲液(pH5.0)中进行.吸附前先将制备好的IMAC介质在缓冲液中平衡24h以上,真空抽滤后准确称取一系列约0.1g的介质于三角瓶中,加入10mL初始浓度为0∼2.0mg/mL的BSA溶液,将三角瓶置于25℃摇床中,在170r/min下振荡20h,取出,离心15min,以未加蛋白的空白为参比液,在280nm下测定上清液的吸光度.根据物料平衡计算吸附量:其中,q为蛋白质的吸附量(mmol/L),c分别采用由pH5.0的吸附缓冲液配制的0.2mol/L咪唑溶液及0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH8.0)对吸附在IMAC介质上的BSA进行洗脱.首先称取2份0.1gIMAC介质于三角瓶中,加入6mL1.5mg/mLBSA溶液,25℃下于160r/min摇床中吸附20h后,离心测定上清液的吸光度,计算吸附在介质上的BSA量.移去上清液后,向介质中分别加入6mL咪唑溶液或pH8.0的磷酸缓冲液对BSA进行洗脱,间隔一定时间测定上清液中洗脱下的BSA浓度,根据物料衡算计算出BSA的洗脱率.2.3分析2.3.1ida配基密度的测定IDA为弱酸,可采用过量强碱滴定后再用盐酸滴定剩余强碱的方式来测定IDA-Sepharose凝胶表面的羧基含量,具体步骤为:准确称取IDA-Sepharose微球0.1g于锥形瓶中,加3滴酚酞指示剂,5mL0.01mol/LNaOH,于室温下振荡反应10min后,用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至红色消失,平行滴定3次,记录所用HCl体积.用下式计算介质上的IDA配基密度:其中,D2.3.2CuIMAC介质上Cu3结果与讨论3.1sdo含量对环氧树脂活性密度的影响虽然史清洪等3.2ech含量对环在以DMSO为溶剂的无水反应体系中,研究了ECH含量对环氧基修饰密度的影响,结果如图3所示.当ECH含量从10%增加到40%(ϕ)时,环氧基密度逐步由94.1μmol/mL增大到136.7μmol/mL;进一步增加ECH含量,环氧基密度却有所降低,这与文献3.3活化温度和时间对环氧基修饰密度的影响图4表明,在40∼60℃之间改变活化反应温度,对环氧基修饰密度的影响并不是特别显著,50℃下活化所得环氧基密度略大于40和60℃.活化反应时间对环氧基的修饰密度的影响较显著(图5),反应时间达4h时,所得环氧基密度最大,之后进一步延长反应时间,环氧基修饰密度呈下降趋势.这与Matsumoto等通过上述实验,确定环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶的最佳反应条件为:不含水的情况下,反应体系中DMSO和ECH的体积分率分别为60%和40%,NaOH用量为0.02g/mL,活化反应温度和时间分别为50℃和4h,所得环氧基密度最高可达163.5μmol/mL,这是国内外报道通过显微镜对环氧基活化前后Sepharose6FF微球进行对比观察,并未发现活化前后微球形态有变化.3.4基密度和密度的影响在上述优化条件下,对约20mLSepharose6FF进行环氧化,测得环氧基密度为144.0μmol/mL,略低于优化条件下所得的最大值(163.5μmol/mL).这是因为优化实验中每次活化的琼脂糖凝胶仅为1g,反应过程中琼脂糖凝胶的分散程度更好.利用所制的ECH-Sepharose,按图2所示步骤依次进行IDA和Cu3.5bsa吸附和洗脱imac介质BSA在IMAC上的吸附量在pH为5∼6时最大吸附在IMAC介质上的蛋白质的洗脱采用竞争性替代剂如咪唑作为洗脱剂4环氧氯丙烷活化的琼脂糖介质(1)以DMSO为溶剂完全取代水,在无水体系中利用环氧氯丙烷对琼脂糖凝