6种方法提取链霉菌基因组dna的比较

6种方法提取链霉菌基因组dna的比较

近年来，生物酶技术和过程研究技术的发展为链霉菌产生的次代谢产物合成机奠定了良好的基础，并将链霉菌基因的dna接收到这些工作的基础。目前,链霉菌基因组DNA提取方法众多,但由于提取机理和步骤的差别,获得DNA的量及纯度各不相同,本研究比较了6种DNA的提取方法,以筛选最佳的链霉菌基因组DNA提取方法,并为进行PCR扩增提供良好的DNA模板。1材料和方法1.1菌株和保藏中心供试菌株为弗氏链霉菌(S.fradiae),委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae),生二素链霉菌(S.ambofaciens),淡青链霉菌(S.glaucescens),天蓝色链霉菌(S.coelicolor),所有菌种均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。1.2d的培养将供试菌株接种于装有100mL培养液的250mL三角瓶中,于150r/min,28℃下培养3d,6500r/min离心15min,弃上清,菌体保存于4℃备用。1.3提取的胎盘dna1.3.1用微波法提取致密蛋白的dna1.3.2tis饱和酚/氯-异戊醇法取0.15g新鲜菌体于研钵(-20℃预冷)中,反复液氮研磨至细粉状,迅速平均分装至2个1.5mL离心管中;加TEBuffer550μL,加65℃预热的20%SDS溶液30μL,漩涡振荡5s,加20mg/mL蛋白酶K20μL,轻轻混匀,37℃保温1h;加等体积Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提,轻微颠倒混匀,10000r/min离心10min;小心吸取上清至新离心管中,加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提,10000r/min离心5min,吸取上清液与等体积异丙醇(4℃预冷)混匀,然后10000r/min离心3min,弃上清。沉淀用1mL70%乙醇(4℃预冷)洗涤1min,自然风干,加入40μLTE溶解,-20℃保存备用。1.3.3%sds法基于酚、氯仿法稍有改变,与优化的SDS法比较,缺少液氮研磨步骤,将加入TEBuffer的新鲜菌体直接用预热的20%SDS处理,其余操作如1.3.2。1.3.4专利基因tab/nacl溶液配制取0.15g新鲜菌体于预冷研钵中,反复液氮研磨至细粉状,迅速平均分装至2个1.5mL离心管中;加TEBuffer400μL,漩涡振荡5s,加20mg/mL蛋白酶K20μL,轻轻混匀,37℃保温1h;加入5mol/LNaCl溶液100μL,CTAB/NaCl混合溶液80μL,轻轻混匀,65℃保温10min;后续操作如1.3.2。1.3.5ctag提取致密dna基于酚、氯仿法稍有改变,与优化的CTAB法相比,缺少液氮研磨步骤,其余操作如1.3.4。1.3.6液氮研磨法提取致密dna与上述方法相比,直接将新鲜菌体进行反复液氮研磨,不加入SDS或CTAB,其余操作如1.3.2。1.4dna纯度、定量和测量方法提取的基因组DNA用TEBuffer适度稀释,在UV-2100紫外分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)上,测定260nm,280nm处的光吸收值,根据260nm与280nm的光吸收比值确定DNA的纯度。根据260nm处的吸收值估测样品DNA的浓度(1.0OD1.5各组dna样品的检测取3μLDNA溶液于0.8%琼脂糖凝胶(80V)电泳45min,于UVP凝胶成像系统中观察并成像。1.616rdnak扩增选用放线菌16SrDNA扩增通用引物2结果与分析2.16不同方法提取组dna结果2.1.1s、ctab、液氮研磨法检测dna结果在6种方法中,优化SDS法得到的委内瑞拉链霉菌基因组DNA效果很好,纯度较高,DNA条带明亮,无拖尾现象,只有少许RNA污染;SDS法获得的基因组DNA条带微弱,有少量RNA污染,但纯度较高;优化CTAB法得到的基因组DNA条带明亮,但纯度较差,拖尾严重;CTAB法得到的基因组DNA纯度较高,但DNA条带微弱,还有少量RNA污染;液氮研磨法得到的基因组DNA纯度较高,但是DNA量非常少;微波法提取的基因组DNA纯度高,有少量的RNA污染,但与优化的SDS法相比,获得的基因组DNA量明显减少,此法可用于DNA的少量快速制备。2.1.2纯度和浓度检测从表1的紫外检测结果可知,6种方法所获得委内瑞拉链霉菌基因组DNA的OD2.2链霉菌基因组dna质量检测结果由于优化SDS法获得的委内瑞拉链霉菌基因组DNA效果好,因而,用此法继续提取弗氏链霉菌、生二素链霉菌、淡青链霉菌、天蓝色链霉菌基因组DNA。在图2中,第1~5道为以优化SDS法分别提取弗氏链霉菌、生二素链霉菌、淡青链霉菌、天蓝色链霉菌、委内瑞拉链霉菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果,各个基因组DNA纯度高,DNA条带清晰、整齐,无拖尾现象,只有少许RNA污染,得到了满意的结果。优化SDS法提取获得的弗氏链霉菌、生二素链霉菌、淡青链霉菌、天蓝色链霉菌、委内瑞拉链霉菌基因组DNA的OD2.316胜销容量将优化SDS法所提取的供试菌株进行16SrDNA扩增,扩增效果见图3,PCR产物基本无拖带与杂带,得到满意的扩增效果。3基于sds法的基因组dna提取链霉菌为革兰氏阳性原核生物,细胞壁厚,因此,其基因组DNA的提取质量取决于破解细胞壁的方法。SDS法和CTAB法为传统的DNA提取方法意大利学者Orsini等利用微波热振惊法直接提取土壤等环境样品的细菌基因组DNA优化的SDS法是6种提取方法中破壁效果最好、最可靠的放线菌DNA提取方法,该法所得的DNA可用于PCR、酶切、测序等。此方法是在SDS法基础上,添加了液氮研磨一步,目的在于在低温液氮作用下,机械研磨破坏细胞壁促使核酸从细胞内释放,明显提高了DNA浓度,低温操作也尽可能防止DNA的降解。DNA纯度、浓度及琼脂糖凝胶电泳检测也证明优化SDS法提取的基因组DNA质量高,基因组DNA浓度较液氮研磨法、SDS法、CTAB法有明显地增加。同时,PCR扩增结果表明,以优化的SDS法所获得的基因组DNA为模板进行16SrDNA基因扩增,扩增产物凝