抗纤益心方抗扩张型心肌病的药效评价

抗纤益心方抗扩张型心肌病的药效评价

扩张性心肌病（cdm）是致充血性心力衰竭的主要原因，严重威胁着人类的健康。目前没有具体的治疗方法。11.1中药免充配方颗粒见图1抗纤益心方组成：红参12g、黄芪30g、丹参15g、白术15g、茯苓12g、泽兰15g、益母草15g、升麻9g、麦冬6g。由四川新绿药业科技发展有限公司提供中药免煎配方颗粒，批号：0074744155,每1.0g颗粒相当于生药8.0g,用生理盐水溶解。辅酶Q10(10mg/片，卫材(中国)药业有限公司，批号：187280)。呋喃唑酮片(0.1g/片，山西云鹏制药有限公司生产，批号：138272)。1.2饲养环境概况80只SPF级SD大鼠，雄性，体重(50±5)g,3w龄大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006,饲养于河南省中医院中心实验室动物中心，饲养环境恒温、恒湿，温度18℃～24℃,湿度50%～70%,12h交替照明。本实验经河南省中医院动物实验伦理委员会审核批准号：20180315WZ。1.3蛋白定量试剂盒苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120-3);MDA、SOD和ATPase检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，货号：mL077384、mL059387、mL038281);BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010);PVDF膜(美国Millipore公司，批号：IPVH0010);SDS凝胶试剂盒(西安晶彩生物公司，批号：JCPE022);抗UCP2抗体(批号：11081-1-AP)、抗β-actin抗体(批号：66009-1-lg),武汉三鹰生物公司。1.4主要成像设备SDS凝胶电泳系统(型号：Mini-PROTEAN)、蛋白湿转仪(型号：MiniTrans-Blot)、WB成像系统(型号：ChemiDocXRS+),美国伯乐公司。1.51.5.1模型准备SD大鼠80只按9∶1分为造模组和正常对照组，造模组每日给予饮用70%呋喃唑酮水溶液诱导DCM1.5.2灌胃盐水的制备将造模成功的40只大鼠通过随机数字表法随机分为模型对照组、抗纤益心方高、低剂量组和辅酶Q10组，每组8只。正常对照组和模型对照组每日灌胃生理盐水。给予抗纤益心方3.6g/kg、1.8g/kg、辅酶Q1020.0mg/kg,连续给药8w。治疗期间模型对照组与药物治疗组继续给予呋喃唑酮水溶液以保证致病因素的持续存在。1.5.3．定向m型示踪用小动物超声心动图在大鼠乳头肌水平进行二维定向M型示踪，测量和计算LVESD、LVEDD、FS、LVEF。所有大鼠由一位专业超声人员进行检测，每项测量连续三次心动周期。1.5.4织物积分评价取4%多聚甲醛固定的心肌组织24h后，常规脱水，石蜡包埋，切片，脱洗，HE染色，观察病理学改变，并对心肌组织进行积分评价，具体评价体系如下：0分，心肌组织无受损，细胞核排列较规则，肌纤维走行较整齐，心肌胶原沉积<5%;1分，轻度心肌受损，局部心肌纤维排列紊乱，心肌胶原沉积<5%～36%;2分，中度心肌受损，心肌纤维排列较紊乱，心肌胶原沉积<36%～60%;3分，重度心肌受损，心肌纤维排列紊乱，局部间质水肿，心肌胶原沉积>60%。1.5.5通过透射电子显微镜和微微镜对心肌细胞的骨骼进行了超微结构和自我分解剪取左心室心尖部位心肌组织，切成3个约1mm1.5.6生物素化抗体按照试剂盒严格要求进行操作，各样本检测之前对其进行匀浆、离心，取上清液，在各孔中加入标准品或样品100μL,37℃孵育90min,倒去孔内的液体，加入100μL生物素化抗体工作液，37℃孵育60min,洗涤3次。加入100μL酶结合物工作液，37℃孵育30min,洗涤5次，加入90μL底物溶液，37℃孵育15min左右，加入50μL的终止液，立即在450nm波长处测量OD值。1.5.7tbt的制备称取大鼠心肌组织100mg,加入RIPA裂解液，在冰上研磨离心，BCA法测定蛋白的浓度后，以4∶1比例加入蛋白上样缓冲液，100℃,5min,进行凝胶电泳，4℃条件下加入一抗孵育过夜，37℃,1h,TBST清洗后，37℃二抗孵育1.5h,TBST洗膜后，采用ECL化学发光法曝光、显影、拍照。以β-actin灰度值为内参，用ImageJ软件定量分析各蛋白相对表达量。1.5.8统计分析实验所得数据采用SPSS21.0统计软件进行分析，符合正态分布的数据以均数±标准差22.1改变lvesd、lvedd和心脏指数与正常对照组比较，模型对照组大鼠LVESD、LVEDD和心脏指数明显增加，FS和LVEF明显降低(2.2部位组织病理学与正常对照组比较，模型对照组心肌组织明显受损，细胞核排列不规则，部分细胞核固缩、碎裂，肌纤维排列、走形紊乱，胶原沉积，并出现间质水肿，局部心肌纤维化严重。与模型对照组比较，抗纤益心方1.8、3.6g/kg组和辅酶Q1020.0mg/kg组心肌细胞形态与纤维排列顺序明显改善，表明抗纤益心方和辅酶Q10能够减轻DCM大鼠心肌组织的形态学结构异常改变，见图1、表2。2.3小鼠小鼠小鼠小鼠肢体状态正常对照组心肌细胞线粒体线状排列呈椭圆形或圆形，线粒体嵴膜丰富完整、清晰，基质清楚。与正常对照组相比，模型对照组线粒体排列紊乱，局部肌丝断裂，线粒体肿胀伴空泡样变化，边界模糊不清。与模型对照组比较，抗纤益心方1.8g/kg、3.6g/kg组和辅酶Q1020.0mg/kg组线粒体形态结构的损伤明显改善，促进心肌能量代谢，见图2。2.4型对照组mda、sod活力、atpase含量比较与正常对照组比较，模型对照组MDA含量明显增加，SOD活力、ATPase含量明显降低(2.5ucp2蛋白表达水平与正常对照相比，模型对照组UCP2蛋白表达明显上调(3临床疗效分析扩张型心肌病在古典医籍中无相关病名描述，根据其临床表现可归属于“喘证”、“胸痹”、“心悸”等范畴。中医认为本病发病多因先天禀赋不足、素体虚弱，或后天失养，或感受毒邪，内舍于心，致心气亏虚。王振涛教授临床长期从事治疗DCM,根据临床经验认为本病早期多以气虚为本，瘀血、水湿为标，疾病晚期可出现心肾阳气虚衰，导致诸脏腑功能失调。气虚是本病发生发展的中心环节，存在于病变过程中的各个阶段，因而提出益气升陷活血法治疗DCM,根据本法自拟抗纤益心方，在临床上取得良好的效果。方中红参大补元气，补脾益肺，且能益血生津；黄芪补气升阳，利水消肿，二者合用共为君药。丹参既活血祛瘀，又能养血补心，麦冬味甘微寒，养阴润肺，清心除烦；且制约参芪术温燥之性，为佐药。益母草、泽兰具有活血祛瘀，利水消肿作用；茯苓具有健脾渗湿，益心安神，白术有补气健脾燥湿等功效。升麻入脾胃经，善引脾胃清阳之气上升，与黄芪共用对气虚下陷之症其效显著。故本方具有益气升陷、活血利水功效。扩张型心肌病主要以心腔扩大，心肌收缩功能减退为特征，发病率和死亡率逐年升高能量代谢异常，氧化应激发生在DCM发生发展过程中起重要作用。MDA是氧自由基引发脂类过氧化反应的产物，其含量高低反映氧自由基水平和脂质过氧化的强度解偶联蛋白-2(uncouplingprotein2,UCP2)作为线粒体内膜的一类轻度解偶联剂，是参与能量代谢的重要转运蛋白，具有调节机体能量代谢的作用。能量的产生以及储存的主要场所是线粒体，在维持细胞的结构、功能和能量代谢等方面具有重要的作用。其通过质子漏机制使线粒体呼吸链氧化磷酸化过程脱偶联，使能量以无效的热能散失，ATP合成减少，UCP2过量表达导