实验五ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg

试验五：ELISA法检测乙肝表面抗原（HBsAg）主讲人：季煜华2023年11月第1页免疫标识技术定义：

将抗原-抗体反应与标识技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标识已知抗体或抗原，通过检测标识物，间接测定未知抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP第2页

用标识物标识抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提升免疫学诊断敏感性荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）免疫标识技术第3页免疫酶测定法

(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高敏捷度：酶催化底物显色高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面抗原。第4页酶联免疫吸附试验

(Enzyme-LinkedImmunoSorbent

Assay,ELISA)酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）,简称ELISA，它是试验室最常用检测办法，用酶标识抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原。

ELISA具有精确性高、检测时间短、价格低廉、判断成果有客观标准、成果便于统计和保存等长处，适合于大批标本检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫试验分析等领域。1.介绍第5页(1).抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性。例如：蛋白质分子构造上疏水基团与聚苯乙烯表面疏水基团能产生互作用而吸附。(2).抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；(3).酶结合物与对应抗原或抗体结合后，可根据加入底物颜色反应来判定是否有免疫反应存在，并且颜色反应深浅是与标本中对应抗原或抗体量成正百分比，由此进行定性或定量分析。2、ELISA基本原理第6页3、ELISA基本试验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化；抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定；酶促反应：在反应体系中加入酶作用底物，使发生酶促反应而显色。第7页

ELISA试剂ELISA中有3个是必要试剂：免疫吸附剂、标识物和显色剂。（1）已包被抗原或抗体固相载体（免疫吸附剂）；（聚苯乙烯板：具有较强吸附蛋白质性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保存本来免疫学活性）（2）酶标识抗原或抗体（标识物）；（3）酶作用底物（显色剂）；（4）阴性对照品和阳性对照品，参照标准品；（5）样品及标准本稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液第8页ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂起源和标本情况以及检测详细条件，可设计出多种不一样类型检测办法，主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕捉法等。4、ELISA类别第9页双抗体夹心法第10页间接法第11页5、操作步骤（以双抗体夹心法ELISA为例）：用抗体包被固相载体加入抗原Sample(二价以上)，温育加入酶标抗体，温育加入底物，显色清洗清洗清洗终止反应，底物显色深浅与待检抗原量成正比。利用已知浓度抗原制成标准品，稀释为梯度浓度，对其最后OD值与浓度作标准曲线，那么样品浓度能够根据最后OD值在标准曲线上查出。第12页试验内容：

双抗体夹心法测定乙肝表面抗原（HBsAg）——定性定量检测第13页1、掌握ELISA（双抗体夹心法）原理2、熟悉ELISA试验操作办法，并理解其应用实验目第14页试验材料HBsAg酶联免疫分析试剂盒HBsAg阳性品，阴性对照品移液枪，枪头湿盒酶标板，酶标仪一次性手套记号笔计时器第15页试验步骤第16页成果判定定性测定定性测定成果判断作出“有”或“无”回答，分别用“阳性”、“阴性”表达。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应最高稀释度即为滴度。根据滴度高低，能够判断标本反应性强弱，这比观测不稀释标本呈色深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。待测孔（P）与对照孔（N）比值（P：N）大于1.5或2者为阳性，N为阴性对照孔。定量测定：酶标仪测定450nm波长下OD值，根据标准曲线计算样品抗原浓度。第17页预期成果阳性：显色为黄色阴性：无色1234阴性阴性阳性阳性第18页ELISA注意事项加样应加在板孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，避免产气愤泡并迅速完成；一种人操作时，一次不宜多于两块板同步测定。洗涤必须彻底，避免产生假阳性；温育常采取温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是试验室中常