微生物工程代谢调控

第三章微生物代谢调整与代谢工程第一节微生物代谢自我调整第二节微生物代谢调控第三节代谢工程微生物工程代谢调控第1页第一节微生物代谢自我调整微生物工程代谢调控第2页微生物代谢是受到高度调整，以下事实能够说明1）微生物生长在含单一有机化合物为能源合成培养基中，全部大分子单体（如氨基酸）合成速率同大分子（如蛋白质）合成速率协调一致，不会浪费能量去合成那些他们用不着东西。2）任何一个单体合成，如能从外源取得并能进入细胞内，单体合成自动停顿，参加这些单体生成酶合成也会停顿；3）微生物只有在有一些有机基质（如乳糖）存在时，才会合成异化这些基质酶；4）如存在两种有机基质，微生物会先合成那些能异化更易利用基质酶，待易利用基质耗竭才开始诱导分解较难利用基质酶；5）养分影响生长速率，从而对应改变细胞大分子组成（如RNA含量）微生物工程代谢调控第3页微生物自我调整部位：1、养分吸收分泌通道大多数亲水分子难于透过细胞膜，需借助一些负责运输酶系统（如透酶）才得以实现；有些是需能。2、限制基质与酶靠近在真核生物中，各种代谢库基质分别存在于由胞膜分隔细胞器内，如在链孢霉中精氨酸存在于细胞质和液泡内，这两处参加精氨酸代谢酶量有很大差异。原核生物控制方式不一样，其中有些酶是以多酶复合物或以细胞膜结合方式存在，类似于酶固定化形式，使它不能自由活动。3、代谢路径通量控制微生物控制代谢物流方法有两种：调整现有酶量、改变已经有酶分子活性

微生物自我调整三个部位实际上也就是三个类型，但都包括到酶促反应调整。

酶促调整方式包含酶活性调整和酶合成调整两大类。微生物工程代谢调控第4页原核生物真核生物微生物工程代谢调控第5页一、酶活性调整（一）酶激活作用和酶抑制作用---两个矛盾过程；普遍存在于微生物代谢中

表3-1大肠杆菌糖代谢中酶激活剂与抑制剂

酶激活剂抑制剂磷酸果糖激酶ADP、GDPPEP丙酮酸脱氢酶PEP、AMP、GDPNADH、乙酰CoA微生物工程代谢调控第6页天冬氨酸转氨甲酰酶ATP激活图3-1嘧啶生物合成限速酶调整方式微生物工程代谢调控第7页大肠杆菌酵解和TCA循环中促进与抑制位点促进抑制微生物工程代谢调控第8页一、酶活性调整（二）酶活性调整方式变(别)构效应共价修饰缔合与解离竞争性抑制

微生物工程代谢调控第9页1、变构控制变构或别构(allosterism)效应是指一个小分子物质与一个蛋白质分子发生可逆相互作用，造成这种蛋白质构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子相互作用。

变构蛋白是表现变构效应蛋白，如阻遏蛋白

含有变构作用酶称作变构酶微生物工程代谢调控第10页变构调整理论：1）变构酶含有一个以上结合位点，除了结合底物活性中心外，在同一分子内还有一些分立效应物结合位点（副位点）；2）主位点和副位点可同时被占据；3）副位点可结合不一样效应物，产生不一样效应；4）效应物在副位点上结合可随即引发蛋白质分子构象改变，从而影响酶活性中心催化活性；5）变构效应是反馈控制理论基础，是调整代谢有效方法。微生物工程代谢调控第11页2、共价修饰指蛋白质分子中一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变作用。化学基团：磷酸基、腺苷酰基、甲基、乙基等蛋白质共价结合部位普通为丝氨酸残基-CH2OH共价修饰分可逆和不可逆两种微生物工程代谢调控第12页有些酶存在活性和非活性两种状态，它们能够经过另一个酶催化作共价修饰而相互转换。如:糖原磷酸化酶

经过激酶和磷酸酯酶来调整活性

磷酸化形式有活性去磷酸化形式无活性1）可逆共价修饰微生物工程代谢调控第13页磷酸化酶E-CH2-OH(无活性)

磷酸化酶E-CH2-O-P(有活性)

H2OPi磷酸酯酶ATPADP磷酸化酶激酶微生物工程代谢调控第14页酶可逆共价修饰意义：1）因酶构型转换是由酶催化，故可在很短时间内经信号开启，触发生成大量有活性酶；2）这种修饰作用可更易控制酶活性以响应代谢环境改变。

这一系统含有能随时响应特征，因而经常在活化与钝化状态之间往返变换。

需消耗能量，但只占细胞整个能量消耗一小部分微生物工程代谢调控第15页2）不可逆共价修饰

经典例子是酶原激活——无活性酶原被对应蛋白酶作用，切去一小段肽链而被激活(胰蛋白酶原活化靠肠肽酶从其N-端切去一个己肽Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)肠肽酶胰酶原胰酶弹性蛋白酶原活化弹性蛋白酶原活化弹性蛋白酶原活化本身催化

信号放大

酶完成使命后便被降解，关闭酶活性

酶原变为酶是不可逆微生物工程代谢调控第16页二、酶合成调整

凡是能促进酶合成调整称为诱导；而能妨碍酶合成调整称为阻遏。

酶合成调整是一个经过调整酶合成量进而调整代谢速率调整机制，这是一个在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）代谢调整。

同调整酶活性反馈抑制等相比，经过调整酶合成而实当代谢调整方式是一类较间接而迟缓调整方式；其优点是经过阻止酶过量合成，有利于节约生物合成原料和能量。微生物工程代谢调控第17页（一）酶合成调整类型诱导阻遏末端产物阻遏分解代谢产物阻遏微生物工程代谢调控第18页组成酶不依赖于酶底物或类似物存在而合成如葡萄糖转化为丙酮酸过程中各种酶诱导酶依赖于某种底物或底物结构类似物存在而合成

如大肠杆菌乳糖利用酶1、酶合成诱导（induction）微生物工程代谢调控第19页

诱导剂能够是诱导酶底物，也可是底物结构类似物如：乳糖是大肠杆菌-半乳糖苷酶合成诱导剂，也是此酶底物

诱导剂也能够不是该酶作用底物如异丙基--D-硫代半乳糖苷（IPTG）是-半乳糖苷酶合成极佳诱导剂，但不是作用底物；

酶作用底物不一定有诱导作用如对硝基苯--L-阿拉伯糖苷是-半乳糖苷酶底物，但不能诱导该酶合成。微生物工程代谢调控第20页酶诱导可分两种：1）同时诱导2）次序诱导当诱导物加入后，同时或几乎同时诱导几个酶合成；主要存在于短代谢路径中。如将乳糖加入到E.coli培养基后，可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶、半乳糖苷转乙酰基酶；不论诱导强度怎样，所以这三种蛋白以同一百分比合成。（因为三者基因组成同一操纵子）先合成能分解底物酶，再依次合成份解各中间代谢物酶，以到达对较复杂代谢路径分段调整。微生物工程代谢调控第21页苯乙醇胺苯乙酮酸苯乙醛苯甲酸顺，顺-粘康酸-酮己二酸L-犬尿氨酸O-氨基苯甲酸L-色氨酸N-甲酰犬尿氨酸-酮己二酰CoA乙酸+琥珀酸儿茶酚丙氨酸甲酸假单孢菌芳香氨基酸降解酶类次序诱导微生物工程代谢调控第22页2、酶合成阻遏(repression)末端产物阻遏(end-productrepression)分解代谢物阻遏(cataboliterepression)微生物工程代谢调控第23页指由某代谢路径末端产物过量积累而引发阻遏。1）末端产物阻遏(end-productrepression)对直线式路径来说，末端产物阻遏情况较简单，即产物作用于代谢路径中各种关键酶，使之合成受阻；对于分支代谢路径而言，情况较复杂，每种末端产物仅专一地阻遏合成它那条分支路径酶。代谢路径分支点以前“公共酶”仅受全部分支路径末端产物阻遏（多价阻遏作用）。末端产物阻遏在代谢调整中有主要作用，确保细胞内各种物质维持适当浓度；普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成路径中。微生物工程代谢调控第24页2）分解代谢物阻遏(cataboliterepression)——是指两种碳源（或氮源）分解底物同时存在时，细胞利用快那种分解底物会阻遏利用慢底物相关分解酶合成现象。or——当培养基中同时存在有各种可供利用底物时，一些酶合成往往被轻易利用底物所阻遏，这就是分解代谢阻遏。微生物工程代谢调控第25页

最经典例子是细胞经过最易利用碳源（如葡萄糖）分解产物来抑制一些酶合成。

这个现象最早在青霉素生产中发觉，可快速利用葡萄糖致使青霉素产量尤其低，而迟缓利用乳糖却能很好地生产青霉素。

深入研究表明，乳糖并不是青霉素合成特殊前体，它价值仅在于迟缓利用。被快速利用葡萄糖分解产物阻遏了青霉素合成酶合成。微生物工程代谢调控第26页把大肠杆菌培养在含有葡萄糖和乳糖培养基中，可显著看到大肠杆菌经历了两个对数期。葡萄糖在第一个周期中被利用。在葡萄糖代谢早期，-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶合成受阻遏，使乳糖不被利用。葡萄糖被消耗完后，乳糖代谢所需酶开始合成，于是出现了利用乳糖第二个生长周期。微生物工程代谢调控第27页

阻遏作用并非快速利用碳源（或氮源）本身作用结果；而是其分解代谢过程中所产生中间代谢物引发；

这种抑制青霉素合成及乳糖利用现象，起初认为只有葡萄糖才会产生，故称为葡萄糖效应。

全部能够快速利用或代谢能源，都能阻遏异化另一个被迟缓利用能源所需酶合成

分解代谢阻遏包括到是一些诱导酶微生物工程代谢调控第28页（二）酶合成调整机制当前认为，由Monod和Jacob提出操纵子假说能很好地解释酶合成诱导和阻遏操纵子(operon)开启基因(promoter)操纵基因(operator)结构基因(structuralgene)RNA聚合酶结合部位操纵基因位于开启基因和结构基因之间，能与阻遏物（一个调整蛋白）相结合，以此来决定结构基因转录能否进行结构基因为一组功效相关基因诱导型操纵子（inducibleoperon）阻遏型操纵子（repressibleoperon）只有当存在诱导物时其转录水平才最高,并随之转译出诱导酶

负责基质分解

如乳糖操纵子只有当缺乏辅阻遏物时其转录频率才最高，即只有经过去阻遏作用才能开启所编码酶合成

负责一些物质合成

色氨酸操纵子微生物工程代谢调控第29页调整基因(regulatorgene)

普通位于对应操纵子附近，也可远离操纵子;编码组成型调整蛋白

调整蛋白(regulatoryprotein)是一类变构蛋白，有两个特殊位点，其一可与操纵基因结合，另一位点可与效应物结合。能在没有诱导物时与操纵基因结合只能在辅阻遏物存在时才能与操纵基因结合阻遏物(repressor):阻遏物蛋白（aporepressor）调整蛋白(可分两种)微生物工程代谢调控第30页效应物(effector)——指一类低分子质量信号物质（如糖类及其衍生物、氨基酸、核苷酸等）。诱导物(inducer)辅阻遏物(corepressor)微生物工程代谢调控第31页1.单一效应物调整--酶诱导机制：（乳糖操纵子）

E.coli乳糖操纵子由lac开启基因(lacP)、lac操纵基因(lacO)和三个结构基因(lacZ、Y、A)所组成，三个结构基因分别编码-半乳糖苷酶、透过酶和转乙酰酶。

乳糖操纵子是负调整代表，在缺乏乳糖等诱导物时，由调整基因(lacI)编码调整蛋白（即lac阻遏物）一直结合在操纵基因上，抑制着结构基因转录进行。

当有诱导物如乳糖存在时，乳糖与lac阻遏物相结合，使后者发生构象改变，不能继续结合在操纵子上，操纵子“开关”被打开，结构基因转录、翻译可顺利进行。

当诱导物耗尽后，lac阻遏物可再次与操纵基因结合，这时转录“开关”又被关闭，酶就无法合成，细胞内酶合成速度急剧下降。微生物工程代谢调控第32页lacIPlacZlacYlacA调整基因结构基因控制部分转录mRNA-半乳糖苷酶透过酶转乙酰基酶利用乳糖生长阻遏蛋白RNA聚合酶O诱导物无活性乳糖操纵子(lacoperon)——酶诱导机制微生物工程代谢调控第33页2.单一效应物调整--阻遏机制:(色氨酸操纵子)

色氨酸操纵子阻遏是对合成代谢酶类进行正调整典例

E.coli色氨酸操纵子也由开启基因、操纵基因和结构基因（5个）三部分组成。5个结构基因分别编码色氨酸合成路径中5种酶。

调整基因(trpR)远离操纵基因，编码阻遏物蛋白；其为由4个亚基组成四聚体；单独四聚体不能和操纵基因(trpO)结合，只有先结合了色氨酸分子后改变了四聚体分子构象才能与trpO结合。

当细胞内色氨酸浓度高时，色氨酸与阻遏物蛋白结合，形成完全阻遏物，与操纵基因结合，阻止结构基因转录（色氨酸为辅阻遏物）。

当细胞内色氨酸缺乏或不足时，则造成阻遏物脱离操纵基因，使操纵基因“开关”打开，结构基因转录又可正常进行。微生物工程代谢调控第34页trpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP邻氨基苯甲酸合成酶-亚基邻氨基苯甲酸合成酶

-亚基吲哚甘油磷酸合成酶Trp合成酶-亚基Trp合成酶-亚基分支酸邻氨基苯甲酸磷酸核糖基邻氨基苯甲酸吲哚甘油磷酸色氨酸羧苯氨基脱氨核糖磷酸微生物工程代谢调控第35页trpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP阻遏物蛋白（无活性）阻遏物阻遏物（有活性）RNA聚合酶结构基因转录翻译色氨酸合成色氨酸转录将重新开始微生物工程代谢调控第36页3.两种效应物共同调整:

(乳糖操纵子调整与大肠杆菌内cAMP浓度相关)

E.coli含有一个代谢产物活化蛋白CAP(cataboliteactivatedprotein)，也称cAMP受体蛋白CRP；CAP和cAMP都是lacmRNA合成所必需。

CAP能与cAMP形成复合物，cAMP-CAP复合物结合在lac操纵子开启基因上，可促进转录进行，实现正调整。

葡萄糖分解代谢中间代谢物能抑制腺苷酰环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低cAMP浓度，此时CAP不能被活化形成cAMP-CAP复合物，从而抑制了lac转录。双重调控微生物工程代谢调控第37页lacIPlacZlacYlacA调整基因结构基因控制部分阻遏蛋白RNA聚合酶O诱导物乳糖操纵子(lacoperon)——分解代谢阻遏CAPcAMP-CAP复合物cAMP腺苷酰环化酶磷酸二酯酶葡萄糖分解转录转录

微生物工程代谢调控第38页4.RNA水平调整机制:弱化调整

Yanofsky1973年研究大肠杆菌色氨酸合成时发觉；当细胞内有色氨酸存在时，可使转录过程在未到终点之前，便有80%-90%转录停顿。这种调整方式不是使正在转录过程全部在中途停顿，故称弱化作用(attenuation)

弱化调整是经过操纵子引导区内类似于终止子结构一段DNA序列实现，这段序列称为弱化子或衰减子(attenuator)

当细胞内某种氨基酰-tRNA缺乏时，该弱化子不表现为终止子功效；当细胞内某种氨基酰-tRNA充分时，弱化子表现为终止子功效，但这种终止作用并不使全部正在转录中mRNA全部都中途停顿，而只是部分中途停顿转录。微生物工程代谢调控第39页

弱化调整方式是在mRNA水平上起作用；

较为广泛地存在于氨基酸合成操纵子调整中，是细菌辅助阻遏作用一个精细调控；

mRNA含有一引导区（在第一个结构基因上游），显示出一个不日常氨基酸密码子堆积。如:色氨酸操纵子两个Trp密码子相邻地位于引导区微生物工程代谢调控第40页trpROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP？组氨酸操纵子弱化子中存在7个组氨酸密码子；苯丙氨酸操纵子弱化子中存在7个苯丙氨酸密码子微生物工程代谢调控第41页游离mRNA中1与2，3与4配对低浓度色氨酸使核糖体停留在1部位，转录得以完成高浓度色氨酸使核糖体抵达2部位，3与4配对，转录终止微生物工程代谢调控第42页三、分支生物合成路径调整1、同工酶（isoenzyme）调整某一分支路径中第一步反应可由各种酶催化，但这些酶受不一样终产物反馈调整.(酶分子结构不一样)如：大肠杆菌天门冬氨酸族氨基酸合成路径中，有三个同工酶：天门冬氨酸激酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分别受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸反馈调整微生物工程代谢调控第43页2、协同反馈调整(concertedfeedbackregulation)需有一个以上终产物过量存在方有显著效果单个终产物过量，不产生或只产生很小影响ABCDEFG微生物工程代谢调控第44页3、累加反馈调整(cumulativefeedbackregulation)每一个末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总效果是累加BACDEFG30%40%58%微生物工程代谢调控第45页4、增效反馈调整(cooperativefeedbackregulation)代谢路径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中第一个酶活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超出各末端产物产生抑制作用总和。BACDEFG15%20%90%微生物工程代谢调控第46页5、次序反馈调整(sequentialfeedbackregulation)分支路径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶，使分支点产物积累，结果分支点产物又反馈抑制共同路径中第一个酶，最终使整个代谢路径停顿。微生物工程代谢调控第47页6、联合激活或抑制调整由一个生物合成中间产物参加两个完全独立、不交叉合成路径控制。这种中间体物质浓度改变会影响这两个独立代谢路径代谢速率。微生物工程代谢调控第48页肠细菌氨甲酰磷酸合成酶联合激活和抑制

肠细菌中精氨酸和嘧啶核苷酸合成路径是完全独立，但它们有一共同中间体——氨甲酰磷酸。

负责合成该中间体酶——氨甲酰磷酸合成酶能够被嘧啶代谢路径代谢物UMP反馈抑制，也可被精氨酸合成路径中中间体鸟氨酸激活。氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸微生物工程代谢调控第49页四、能荷调整能荷（energycharge）——指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能高能磷酸键量度。能荷调整——指细胞经过改变ATP、ADP、AMP三者百分比来调整其代谢活动，也称腺苷酸调整。微生物工程代谢调控第50页能荷不但调整形成ATP分解代谢酶类（如磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶等）活性，也调整利用ATP生物合成酶类（如柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等）活性。R代表ATP合成酶系统U代表ATP消耗酶系统

微生物工程代谢调控第51页微生物工程代谢调控第52页第二节微生物代谢调控微生物工程代谢调控第53页

在工业生产中却往往需要单一地积累某种产品，这些产品量又经常是大大地超出了细胞正常生长和代谢所需范围；

要到达过量积累某种产品目标，提升生产效率，必须使原有调整系统失去控制，在确保微生物适当生存条件下，建立起新代谢方式，使微生物代谢产物按照人们意志积累。

代谢反应协调是经过细胞本身代谢调控系统对细胞机能实施精细控制来到达；

对于生命过程来说，代谢反应协调是必要；概述微生物工程代谢调控第54页一、克服反馈抑制和反馈阻遏调控反馈调整反馈抑制反馈阻遏克服反馈调整，可从以下两方面着手：

降低末端产物浓度应用抗反馈突变株微生物工程代谢调控第55页1、降低末端产物浓度1）营养缺点型利用

营养缺点型是指原菌株因基因突变致使合成路径中止，丧失了合成某种必须物质能力，而必须在培养基中加入对应物质才能正常生长突变菌株。

营养缺点型突变株代谢流受阻，末端产物降低，解除了末端产物参加反馈调整，可使代谢路径中某一中间产物积累。微生物工程代谢调控第56页例1：利用营养缺点型积累直链代谢路径中间代谢产物微生物工程代谢调控第57页ABCDEEaEbEcEd

若要积累C，首先要取得缺失酶c营养缺点型。

酶c缺失后，物质C便不再转变成物质D，不再合成物质E。

因为这种突变体已不能合成末端产物E，所以就解除了E对酶a和酶b反馈调整。反馈抑制反馈阻遏Ec缺点C微生物工程代谢调控第58页不过，完全不能合成产物E突变体，因为不能利用E去深入合成必须细胞物质，所以无法正常生长。为了确保突变体正常生长，培养时须提供低浓度、不足以引发反馈调整物质E。这么高浓度中间产物C就能积累起来了。比如：利用枯草杆菌精氨酸缺点型生产瓜氨酸，利用大肠杆菌赖氨酸缺点型生产苏氨酸，都是这个道理。微生物工程代谢调控第59页例2：利用营养缺点型积累分支代谢路径中中间产物微生物工程代谢调控第60页ABCDEFGHIJMNKL末端产物L和N共同对酶a施以反馈;另外，L抑制酶J1，N抑制酶J2J1J2选取缺失酶J1突变株，则L合成受阻。L和N共同对酶a反馈被解除。又因为酶J2还受到N调整，只有少许J能转变成N，于是中间产物J大量积累。J1缺点J

微生物工程代谢调控第61页谷氨酸棒杆菌IMP合成路径和代谢调整工业上用谷氨酸棒杆菌腺苷酸缺点型生产肌苷酸（IMP）即是此例应用。微生物工程代谢调控第62页在分支路径中，假如降低某一末端产物浓度，经常能够积累另一末端产物。例3：利用营养缺点型积累分支代谢路径末端产物工业上应用主要例子是赖氨酸发酵微生物工程代谢调控第63页C.glutamicum代谢调整与赖氨酸生产◆天冬氨酸半醛生成高丝氨酸路径受阻之后，苏氨酸生成降低。◆苏氨酸与赖氨酸合作进行反馈抑制便被打破，于是赖氨酸能够大量积累。微生物工程代谢调控第64页2）渗漏缺点型利用渗漏缺点型——是一个特殊营养缺点型，是遗传性代谢障碍不完全突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少许生长。不会产生过量末端产物，因而能够避开反馈调整，但它又能合成微量末端产物，用来进行生物合成；在培养这种突变体时，可无须在培养基中添加对应物质，就能积累所需产物。微生物工程代谢调控第65页渗漏缺点型取得方法：把大量营养缺点型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长尤其慢而菌落小即可。应用实例:利用渗漏型育整天门冬氨转甲酰酶活力提升500倍菌株该菌株为尿嘧啶渗漏缺点型，当培养基中少许尿嘧啶消耗后，为尿嘧啶所反馈抑制天门冬氨转甲酰酶活力增加500倍微生物工程代谢调控第66页3）提升细胞渗透性

细胞内合成发酵产物若要分泌到培养基中，必须经过细胞膜和细胞壁。假如产物不易分泌出细胞，而积累在细胞内，则会引发反馈调整。

改变细胞膜和细胞壁通透性，使其有利于产物分泌，也是降低末端产物浓度一个路径。微生物工程代谢调控第67页

谷氨酸生产菌细胞膜磷脂含量高时，细胞通透性较差，磷脂含量低时，通透性很好。

通常在培养基中添加一些控制原因，以到达影响细胞膜磷脂含量目标。如可使用青霉素来使细胞壁完整合成受阻。

细胞壁和细胞膜通透性增大后，产物易于泄出，于是就降低了谷氨酸在细胞内积累。微生物工程代谢调控第68页2、抗反馈调整突变株利用

在以积累末端产物为目标发酵生产中，假如代谢路径单一无分枝，往往不能选取营养缺点型突变株。要提升产量，最好采取抗反馈调整突变株。

抗反馈调整突变株是一个解除合成代谢反馈调整机制突变型菌株。其特点是所需产物不停积累，不会因其浓度超量而终止生产。微生物工程代谢调控第69页

抗反馈突变株因为基因突变，它们酶或无活性原阻遏物不再与末端产物结合，从而不再发生酶变构及阻遏物活化，或者活性阻遏物不能再与发生了突变操纵基因结合，所以反馈调整被打破，即使在末端产物过量情况下，也一样能够积累高浓度末端产物。微生物工程代谢调控第70页

末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引发反馈，不过它们不能参加生物合成。

在培养基中添加末端产物类似物后，未突变细胞将因为代谢路径受阻而不能取得生物合成所需该种末端产物，从而造成细胞死亡。

那些对类似物不敏感突变体，则因为原来受反馈控制酶结构，或是酶合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏影响，在类似物充满情况下照常能合成该种末端产物。微生物工程代谢调控第71页在工业上，生产氨基酸、嘌呤、嘧啶和维生素生产菌种大都是抗反馈突变株。比如，用类似物D-精氨酸选出谷氨酸棒杆菌抗反馈突变株可使L-精氨酸产量得到提升。微生物工程代谢调控第72页二、克服分解代谢阻遏调控生产中要克服分解代谢阻遏可采取以下办法微生物工程代谢调控第73页1、防止使用有阻遏作用碳源和氮源可采取相对来说不引发分解代谢阻遏碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有机酸和黄豆饼粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培养荧光假单胞菌，因为克服了半乳糖分解代谢阻遏，结果在细胞中所产生纤维素酶提升了1500倍。微生物工程代谢调控第74页2、流加碳源或氮源在考虑经济效益而必须使用有阻遏作用碳源或氮源时，迟缓流加碳、氮源可使分解代谢产物维持在较低水平上，而不至于产生阻遏。微生物工程代谢调控第75页如调整基因发生突变，使产生阻遏蛋白失活，不能与末端分解代谢产物结合；或操纵基因发生突变使阻遏蛋白不能与其结合，都能取得抗分解代谢阻遏突变株。3、利用抗分解代谢阻遏突变体微生物工程代谢调控第76页筛选方法：在以酶受阻遏底物为唯一氮源培养基上，选择能正常生长菌落。比如：把鼠伤寒沙门氏菌培养在葡萄糖-脯氨酸琼脂上，因为脯氨酸氧化酶被葡萄糖阻遏，所以采取脯氨酸为唯一氮源。未突变菌株脯氨酸氧化酶被阻遏，而无法利用脯氨酸作为氮源，菌株不能生长；抗分解代谢阻遏突变株则能够利用脯氨酸而正常生长。微生物工程代谢调控第77页三、对诱导调整控制在生产上为了提升诱导酶产量，对诱导调整控制惯用伎俩有：微生物工程代谢调控第78页1、添加诱导物类似物

在诱导物就是酶底物情况下，添加底物类似物来加强诱导作用是最好。

因为底物类似物不易被所形成酶分解，而在细胞中一直保持较高浓度，能够连续地诱导酶合成，取得较高浓度酶。比如:用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导-半乳糖苷酶合成微生物工程代谢调控第79页2、添加辅酶或辅助因子在有些情况下，必须在培养基中添加辅酶才会产生诱导作用比如：丙酮酸脱羧酶合成需有硫胺存在微生物工程代谢调控第80页3、利用组成型突变株

突变能够除去酶合成时对诱导物依赖组成酶突变株在没有诱导物存在时，能照常合成诱导酶

在生产中使用组成酶突变株时，可无须在发酵液中添加诱导物，且产生诱导酶活性也比原菌株强。微生物工程代谢调控第81页比如把大肠杆菌半乳糖苷酶诱导型菌株经诱变处理后，先在含乳糖培养基中培养，因为组成型突变株半乳糖苷酶合成不需诱导即能产生，所以可较诱导型出发菌株较早开始生长，在一定时间内菌数增加便较快。如连续进行培养，因为诱导酶形成后，原菌株生长速率亦逐步增加，这种选择性造成差异就会降低。可用交替在乳糖、葡萄糖培养基中进行培养方法。二者利用葡萄糖时生长速率是相同，乳糖为碳源造成组成型菌株优势生长会连续下去。微生物工程代谢调控第82页

在平板上识别组成型突变株方法，主要是利用在无诱导物存在时进行培养，它能产生酶，加入适当底物进行反应显示酶活以识别。

如甘油培养基平板上培养大肠杆菌时，诱导型菌株不产酶，组成型菌株可产生半乳糖苷酶。菌落长出后喷布邻硝基苯半乳糖苷，组成型菌株菌落因为能水解它而展现硝基苯黄色，诱导型则无颜色改变。

通常使用酶解后能够有颜色改变底物，便于快速检出组成型菌落。微生物工程代谢调控第83页微生物工程代谢调控第84页第三节代谢工程微生物工程代谢调控第85页一、代谢工程概述1、代谢工程基本定义代谢工程(MetabolicEngineering)——利用生物学原理，系统分析细胞代谢网络，并经过DNA重组技术合理设计细胞代谢路径及遗传修饰，进而完成细胞特征改造应用性学科。微生物工程代谢调控第86页1974年，Chakrabarty在假单胞菌属两个菌种中分别引入几个稳定重组质粒，从而提升了对樟脑和萘等复杂有机物降解活性。这是代谢工程技术应用第一实例。1991年JamesE.Bailey(CaliforniaInstituteofTechnology)首次使用该术语又称路径工程(Pathwayengineering)微生物工程代谢调控第87页2、代谢工程基本过程1）靶点设计

最终，依据代谢流分布和控制分析结果确定路径操作合理靶点。通常包含拟修饰基因靶点、拟导入路径靶点或拟阻断路径靶点等。最少包含三个基本过程正确靶点设计必须对现有代谢路径和网络信息进行更深入分析。

首先，依据化学动力学和计量学原理定量测定网络中代谢流分布（即代谢流分析;Metabolicfluxanalysis,MFA），其中最主要是细胞内碳和氮元素流向百分比关系。

其次，在代谢流分析基础上调查其控制状态、机制和影响原因（即代谢流控制分析；Metabolicfluxcontrolanalysis,MCA）。微生物工程代谢调控第88页2)基因操作

利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络关键是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作。

其中最经典形式包含基因或基因簇克隆、表示、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标细胞染色体DNA上稳定整合。微生物工程代谢调控第89页3）效果分析

一次性代谢工程设计和操作往往不能到达实际生产所要求产量、速率和浓度，因为大部分试验包括只是单一代谢路径相关基因、操纵子或基因簇改变。

经过对新代谢进行全方面效果分析，这种由初步路径操作构建出来细胞所表现出限制与缺点，能够作为新一轮试验改造目标。微生物工程代谢调控第90页3、代谢工程基本原理代谢工程是多学科高度交叉新型领域，包括很多基本原理：1）包括细胞物质代谢规律及路径组合化学原理，它提供了生物体基本代谢图谱和生化反应机制。2）包括细胞代谢流及其控制分析化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理，这是代谢路径修饰理论依据。3）包括路径代谢流推进力酶学原理，包含酶反应动力学、别构抑制效应、修饰激活效应等。4）包括基因操作与控制分子生物学和分子遗传学原理，它们说明了基因表示基本规律，同时也提供了基因操作一整套技术。微生物工程代谢调控第91页5）包括细胞生理状态平衡细胞生理学原理，它为细胞代谢机能提供了一个全景式描述，所以是一个代谢速率和生理状态表征研究理想平台。6）包括发酵或细胞培育工艺和工程控制生化工程和化学工程原理，它为速率过程受限制系统分析提供了独特工具和经验。7）包括生物信息搜集、分析与应用基因组学、蛋白质组学原理，为代谢路径设计提供信息，是代谢工程技术迅猛发展和广泛应用最大推进力。微生物工程代谢调控第92页二、代谢工程研究对象简单地说，代谢工程研究对象就是代谢网络细胞分解代谢路径、合成代谢路径和膜传输系统有序组合组成代谢网络。广义代谢网络包含物质代谢网络