从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座

生物大分子分离纯化和

特定酶分离纯化技术路线设计16级长学制临床三班范佳祺常钰涵赵瑾冯璞从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第1页目录1.研究目标2.主要内容3.研究方法和伎俩4.文件综述5.工作进度安排6.预期结果从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第2页1.研究目标锻炼自主学习和查阅文件能力锻炼设计试验能力从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第3页2.主要内容自主设计从生物样品中分离纯化生物大分子技术路线设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和判定一个酶技术路线并了解试验各步骤原理从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第4页3.研究方法和伎俩研究方法：文件研究法——搜集整理相关研究资料为研究做准备研究伎俩：以传统文件检索伎俩为主，辅以网络、数据库等伎俩，开展资料、搜集数据整理等工作从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第5页4.文件综述生物大分子分类：蛋白质、核酸、脂质、糖类接下来分类讲解怎样从生物样品中分离纯化以上四类生物大分子技术路线从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第6页4.1.1蛋白质分离纯化分离方法：透析超滤除蛋白质溶液中小分子化合物浓缩方法：丙酮沉淀、盐析、免疫沉淀纯化方法：电泳、层析从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第7页4.1.2核酸分离纯化——DNA①先将饥饿数天试验动物杀死以除去肝糖原；②然后利用淀粉酶除去多糖；③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离；④利用去污剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白质；⑤利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第8页4.1.2核酸分离纯化——RNA前四步与DNA分离纯化方法相同，之后可经过苯酚水溶液抽提或脱氧核糖核酸酶处理除去DNA。可再利用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法提取所需种类RNA。从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第9页4.1.3脂质分离纯化利用FolchMethod从组织中分离和纯化脂质先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取组织液1:20量和氯仿/甲醇一起组织匀浆，分层后在室温下在摇床中摇动15到20分钟匀浆经过滤纸过滤或者离心取得液体在离心取得液体中加入0.2倍体积（4ml）水或者0.9%生理盐水涡旋几秒钟后混匀，然后rpm离心得到两相溶液，经过虹吸去掉上层用作神经节苷脂类分析和有机小极性分子分析，假如需要话用甲醇/水（1/1）溶液将两相界面洗一到两次，洗过程不要让甲醇/水与下层混合经过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相中含有脂质，假如体积在2到3ml以下，则经过真空旋转蒸发器或在氮气下浓缩从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第10页4.1.4糖类分离纯化提取：动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，普通需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚混合液进行回流脱脂，释放多糖。分离：分级沉淀法、金属络合物法、制备性区域电泳、色谱分离法和膜分离法。其中分级沉淀法主要有有机溶剂分步沉淀法、盐析法及季铵盐沉淀法；色谱分离法分为凝胶柱色谱和离子交换色谱法；膜分离法主要有超滤和微滤法。纯化：Sevagr法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法、盐酸法、酶法、有机溶剂混正当除去蛋白质。用透析法、柱离子交换法和纤维滤器透析法去离子。从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第11页4.2设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和判定一种酶（该酶由三种不一样亚基组成，为结合酶，pI=6.2）技术路线并了解试验各步骤原理材料的选择技材料的预处理术酶的提取路酶的分离线酶的纯化酶纯度的检验从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第12页4.2.1材料选择因动物肝脏中酶往往结合较多脂质、核酸物质，所以取饥饿24小时动物肝脏为试验材料。从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第13页4.2.2材料预处理细胞破碎：机械破碎法。可选用捣碎法或匀浆法。使用匀浆法时应先将大块组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。预防蛋白酶水解作用：预防办法是加入蛋白酶抑制剂。惯用丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸）除核酸：除核酸惯用方法是沉淀法。从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第14页4.2.3酶提取盐溶液提取：适合用于大多数酶。盐溶现象：大多数P酶在低浓度盐存在条件下，酶溶解度随盐浓度升高而增加。盐析现象：在盐浓度到达某一界限后，酶溶解度随盐浓度升高而降低。从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第15页4.2.4酶分离等电点沉淀法：已知所需酶pI=6.2，故适宜采取此种方法进行分离。

等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不一样两性电解质等电点不一样这一特征，经过调整溶液pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离方法。在溶液pH值等于溶液中某两性电解质等电点时，该两性电解质分子净电荷为零，分子间静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。所以能够经过调整介质pH，把目标酶和杂蛋白分开。但因为蛋白质在pI点附件一定范围pH内都可发生沉淀，只是沉淀程度很不一样，而且相当多蛋白质pI点很靠近，所以该法回收率和纯化倍数都不理想，普通只用于酶粗分离阶段。从动物肝脏组织中分离提取纯化和鉴种酶的技术路线专家讲座第16页4.3.5酶纯化结晶：盐析结晶法——加固体盐法、饱和盐溶液、透析扩散法。浓缩：真空蒸发浓缩——在一定真空条件下，使酶液在60℃以下汽化蒸发，进行浓缩过程。普通说来，在不影响酶活力前提下，适当提升温度、降低压力、增大蒸发面积都能够使蒸发速度提升。干燥：真空干燥法——真空干燥是在与真空系统相连接密闭干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低温度条件下蒸发干燥过程。在真空泵之前需要设置水蒸气凝结搜集器，以免汽化产生水蒸气