遗传学实验细菌转导专家讲座

试验次序：先做后讲，因为中间需要等候2小时分组方案：2人制备λ噬菌体裂解液

2人涂受体菌平板和点加λ噬菌体试验七、细菌不足转导遗传学实验细菌转导专家讲座第1页五、试验步骤

（一）噬菌体裂解液制备（制备λdgal＋）5ml供体菌3000rpm10min（多组）吸去上清4mlPB重悬预防污染！重悬液取2ml打开盖，UV15S加2ml2LB

轻摇混匀盖上盖，37℃避光（抑制光修复）遗传学实验细菌转导专家讲座第2页1-N：张三李四王五赵六1.按右图在EMB平板上做好标识2.用受体菌涂出两条菌带（1-2环菌/条）3.37℃倒置培养1.5小时（二）转导（点滴法）步骤遗传学实验细菌转导专家讲座第3页试验七、细菌不足转导一、试验目标（一）了解转导基本原理（二）掌握转导试验基本方法（三）验证细菌遗传物质能够经过噬菌体转移二、试验原理(一）转导概念：转导是以噬菌体为媒介所进行细菌遗传物质重组过程。在这一过程中，细菌一段染色体被错误地包装在噬菌体蛋白质外壳内，并经过感染而转移到到另一个受体细菌内遗传学实验细菌转导专家讲座第4页JoshuaLederberg(1925-)1958年获诺贝尔奖（二）转导发觉

由Lederberg和Zinder于1952年发觉遗传学实验细菌转导专家讲座第5页鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）两种营养缺点型LA2:phe+trp+tyr+his-LA22:phe-trp-tyr-his+基本培养基基本培养基单独培养遗传学实验细菌转导专家讲座第6页基本培养基LA22+LA2混合培养LA2:phe+trp+tyr+his-LA22:phe-trp-tyr-his+遗传学实验细菌转导专家讲座第7页LA22LA2FA?U形管培养LA2:phe+trp+tyr+his-LA22:phe-trp-tyr-his+吹/吸遗传学实验细菌转导专家讲座第8页LA22菌株上清液基本培养基+RNA酶+LA2菌株+DNA酶+LA2菌株基本培养基噬菌体介导遗传物质转移转导菌落裂解？P22发生机理“Weweren'tlookingfortransduction--webumpedintoit”.遗传学实验细菌转导专家讲座第9页(三）转导类型P22噬菌体λ噬菌体1.普遍性转导能够转导细菌染色体组任何部分，比如P22噬菌体介导转导2.不足转导只能转导细菌染色体组特定部分，比如λ噬菌体介导转导遗传学实验细菌转导专家讲座第10页ABBBA转导噬菌体普遍性转导能够转导细菌染色体组任何部分（比如：P22噬菌体）A基因组任何部分都可能经过转导噬菌体进入B基因组遗传学实验细菌转导专家讲座第11页细菌染色体λ

(dgal+)λ

(dbio+)λ原噬菌体不足转导只能转导细菌染色体组特定部分（比如:λ噬菌体只能插到宿主基因组gal和bio之间，所以只能转移gal或bio基因）遗传学实验细菌转导专家讲座第12页噬菌体由外壳蛋白和DNA组成基因组DNA全长48.5kb最少有61个基因头部包装上限为51kb（四）本试验原理遗传学实验细菌转导专家讲座第13页5’GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGA5’

3’3’coscoscos环化λ噬菌体DNA环化遗传学实验细菌转导专家讲座第14页ADCBλ噬菌体DNA插入大肠杆菌基因组ADCB溶源性细菌原噬菌体细菌基因组DNAgal+遗传学实验细菌转导专家讲座第15页插入宿主菌基因组原噬菌体随宿主菌分裂而增殖，当受到紫外线照射或温度改变时能够造成阻遏物失活，使裂解相关基因表示，噬菌体DNA环出、复制、转录、翻译、包装，细菌裂解，释放出数百个新噬菌体环出、复制、转录、翻译、包装裂解释放子代噬菌体遗传学实验细菌转导专家讲座第16页在环出、复制、包装过程中偶然会发生错误而产生转导噬菌体（频率≈10-6)转导噬菌体能感染宿主菌，但因为DNA缺失，不能独立完成复制、包装等过程，所以是缺点噬菌体溶菌控制晚期控制DNA合成控制阻遏早期控制重组删除与整合尾部合成头部合成λ噬菌体基因组DNA各部分功效遗传学实验细菌转导专家讲座第17页λ

(dgal+)E.coliK12Sgal－E.coliK12Sgal－受体菌受体菌λ半乳糖EMB培养基经过转导噬菌体取得gal+基因受体菌称为转导子转导子因能利用半乳糖而产生大量酸，在EMB培养基上显示为紫色,并带有金属光泽gal+转导子gal-非转导子非转导子因不能利用半乳糖而不产生大量酸，在EMB培养基上显示为白色遗传学实验细菌转导专家讲座第18页E.coliK12(λ)gal+是一个双重溶源菌λ(dgal+)λ裂解液中

(dgal+)(转导噬菌体)占50%(正常噬菌体)占50%宿主菌染色体本试验所用供体菌遗传学实验细菌转导专家讲座第19页三、试验材料

供体菌：E.coliK12(λ)gal+

受体菌：E.coliK12S

gal-四、试验器具和药品1.器具：培养皿，试管，离心管，接种棒，移液器2.培养基：LB液体培养基，2×LB液体培养基，半乳糖EMB培养基。（配制方法见《遗传学试验指导》）3、试剂：磷酸缓冲液（PB）、氯仿

遗传学实验细菌转导专家讲座第20页五、试验步骤

（一）噬菌体裂解液制备（制备λdgal＋）37℃过夜取1ml100mlLB5ml供体菌37℃3hr3000rpm10min（多组）E.coliK12(λ)gal+吸去上清4mlPB重悬预防污染！遗传学实验细菌转导专家讲座第21页3000rpm10min（多组）噬菌体裂解液细胞碎片重悬液取2ml噬菌体裂解液取1ml打开盖，UV15S（诱发SOS反应）加0.2ml氯仿猛烈震荡30秒（促进裂解）2hr后移入离心管盖上盖，37℃避光（抑制光修复）加2ml2LB

轻摇混匀遗传学实验细菌转导专家讲座第22页1-N：张三李四王五赵六1.按右图在EMB平板上做好标识2.用受体菌涂出两条菌带（1-2环菌/条）3.37℃倒置培养1.5小时4.在两个圆圈中各接种一环噬菌体5.在四个方格中各接种一环噬菌体(预防污染）6.

37℃倒置培养48-72小时后观察结果（二）转导（点滴法）步骤遗传学实验细菌转导专家讲座第23页试验材料供体菌（gal＋，用于制裂解液，分发，1管/组）半乳糖EMB平板（超净台内，2块/组）灭菌空培养皿（超净台内，1个/组）灭菌离心管（超净台内，2支/组）

受体菌（gal－，用于涂EMB平板，超净台内，公用）

PB（磷酸缓冲液，超净台内，公用）2×LB（超净台内，公用）氯仿（超净台内，公用）仪器设备离心机（201室右侧，公用）培养箱（206室右侧，公用）遗传学实验细菌转导专家讲座第24页本试验结果讨论张三