金免疫标记技术

金免疫标记技术金免疫标记技术第1页知识目标技能目标素质目标1.掌握金免疫标识技术原理和分类2.了解标识物制备3.了解金免疫检测临床应用1.会金免疫标识物制备操作2.会熟练操作金免疫检测过程树立严厉认真、实事求是、高度负责科学态度，含有良好职业素质和高尚职业道德。

任务目标金免疫标记技术第2页任务对象肺炎支原体抗体检测

金免疫标记技术第3页

任务过程

复习提问

案例导入

讲解与示教学生操作讨论分析

评价、考评

课后思索题教学环节2′30′2′10′40′5′1′金免疫标记技术第4页

患儿，女，11岁，间断发烧1周，伴咳嗽3天。体温最高39。1度，病程第2天查血常规正常，诊疗“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无显著改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提醒：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？怎样快速诊疗？案例导入金免疫标记技术第5页

斑点金免疫层析法演示

肺炎支原体诊疗试剂盒讲解与示教金免疫标记技术第6页

二用采血针采指尖血一洗净双手四马上加1-2滴缓冲液

三将1滴指尖血滴入加样孔操作金免疫标记技术第7页步骤5：15分钟读取结果

？？结果？？结果金免疫标记技术第8页老师纠正点评

学生操作一位学生操作演示学生分组再操作金免疫标记技术第9页讨论分析提出问题为何在小小试纸条上出现两条红线就是阳性结果，如此简单、方便方法可靠吗？有假阳性或假阴性可能吗？怎样检测出来，原理是什么？金免疫标记技术第10页胶体金标识技术(Immunogoldlabelingtechnique)

是以胶体金作为示踪标识物，应用于抗原抗体反应一个新型免疫标识技术。讨论分析金免疫标记技术第11页胶体金标识技术讨论分析金免疫标记技术第12页（一）金免疫检测原理胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小金颗粒，并因为静电作用成为一个稳定胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子正电荷基团形成牢靠结合，因为这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质生物特征。胶体金除了与蛋白质结合以外，还能够与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。依据胶体金一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物免疫和生物学特征，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。讨论分析金免疫标记技术第13页Geobegan等将胶体金标识抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平免疫金染色。Faulk和Taylor首创胶体金标识免疫电镜技术胶体金标识技术深入发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等各种标识免疫检测方法1971年1978年多年来讨论分析金免疫标记技术第14页讨论分析枸橼酸三钠还原法鞣酸—枸橼酸钠还原法依据不一样还原剂能够制备大小不一样胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒方法金免疫标记技术第15页胶体金制备

1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。（2）15nm胶体金颗粒制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混匀即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。依据需要快速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这么制成胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm讨论分析金免疫标记技术第16页2．鞣酸—枸橼酸钠还原法

A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。

B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/LK2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下快速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得金颗粒直径为5nm。如需要制备其它直径金颗粒，则按表15-1所列数字调整鞣酸及K2CO3用量

讨论分析金免疫标记技术第17页（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理玻璃器皿，或用第一次配制胶体金稳定玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。不然影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒稳定性，不能取得预期大小金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格纯净，全部试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中聚合物和其它可能混入杂质。制备高质量胶体金注意事项

讨论分析金免疫标记技术第18页（3）配制胶体金溶液pH以中性（pH7.2）很好。（4）氯金酸质量要求上乘，杂质少。最好是进口。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，因为氯金酸易潮解，所以在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。制备高质量胶体金注意事项讨论分析金免疫标记技术第19页

缺点金标法

优点

灵敏度不如酶标技术普通作为定性，不易定量。讨论分析金免疫标记技术第20页自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程仅需3-20分钟。示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后颜色标识讨论分析可单份检测，稳定性好金免疫标记技术第21页斑点金免疫层析试验夹心法竞争法双抗原夹心法双抗体夹心法讨论分析分类金免疫标记技术第22页

双抗体夹心法G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：特异性抗体

吸水纸标本讨论分析金免疫标记技术第23页讨论分析金免疫标记技术第24页竞争法标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原

吸水纸阳性结果讨论分析金免疫标记技术第25页标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原吸水纸阴性结果讨论分析金免疫标记技术第26页讨论分析金免疫标记技术第27页

斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，快速加抗体（抗原），再加金标识第二抗体，因为有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人免疫缺点病病毒