魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展

汇报内容魏氏梭菌概述魏氏梭菌毒素研究

综述

分型及其依据魏氏梭菌产生毒素四种主要毒素研究进展纯化及判定细菌毒力魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第1页综述革兰氏阳性有荚膜不运动厌氧大杆菌，芽孢椭圆形,位于菌体中央或次极端，芽胞直径小于菌体，在普通培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成芽胞（菌体形态）广泛分布于自然界，同时也是肠道中常见菌之一，在一定条件下，可引发各种严重疾病发病急、死亡快，所以对于本病防制主要用疫苗进行免疫预防危害：猝死症，家禽坏死性肠炎，人食物中毒及气性坏疽；家畜肠毒血症、坏死性肠炎，痢疾魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第2页培养特征本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度要求并不太严，2%~10%CO2条件下，生长更加好在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更加好生长适宜温度为37-47℃，多认为43-47℃为最宜温度，在适宜条件下增代时间仅8min魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第3页培养特征血平板：双层溶血环

内环完全溶血-θ毒素外环不完全溶血-α毒素蛋黄琼脂平板：Nagler反应庖肉培养基：数小时即可见到生长，产生大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但不被消化

牛乳培养基：“汹涌发酵”（stormyfermentation）魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第4页分型及其依据依据此菌产生外毒素种类，可将其分为A、B、C、D和E5个型A型菌：αB型菌：αβεC型菌：αβD型菌：αεE型：αι魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第5页魏氏梭菌与对应疾病其中，A型菌主要引发人气性坏疽和食物中毒，也可引发动物气性坏疽，牛、绵羊、家兔肠毒血症B型菌主要引发羔羊痢疾；C型菌主要是牛、猪肠毒血症、羊猝狙D型菌引发羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠肠毒血症；E型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但极少发生。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第6页气性坏疽发病急剧，后果严重，需要尽早准确做出微生物学诊疗，争取早期治疗：标本镜检：可发觉G＋大杆菌，并伴有其它杂菌和少许形态不规则白细胞。培养基厌氧培养深入判定:牛乳培养基生化反应：TSC动物试验：泡沫肝试验

分离诊疗魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第7页纯化液体培养基65-70°C半小时43°温箱培养3-4小时连续传代镜检TSC.石蕊牛奶血平板魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第8页

侵袭力：病原菌有突破宿主皮肤、黏膜

生理屏障等免疫防御机制，进

入体内定居、繁殖和扩散能

力，包含荚膜、粘附素和侵袭

性物质。

毒素：含有损害宿主组织、器官并引发生理功效紊乱大分子成份。毒力细菌毒力魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第9页荚膜、微荚膜。

黏附素：细菌表面蛋白质。

菌毛分泌物

细菌表面组分：如磷壁酸。2、侵袭性物质：帮助病菌抗吞噬或向四面扩散。如致病性葡萄球菌凝固酶、A群链球菌透明质酸酶、链激酶等从而有利于细菌在组织中扩散。㈠侵袭力1、菌体表面结构魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第10页细菌在生长繁殖中产生和释放毒性成份，可直接或间接损伤宿主细胞、组织和器官，干扰其生理功效。外毒素内毒素（二）毒素

魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第11页内毒素毒性作用(A)热源性(C)内毒素血症和休克(D)弥漫性血管内凝血（DIC）(B)白细胞数目改变魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第12页区分关键点外毒素内毒素存在部位由活细菌释放至细菌体外为细菌细胞壁结组成份，菌体崩解后释出细菌种类革兰阳性菌多见革兰阴性菌多见化学组成蛋白质脂多糖稳定性60℃～80℃30min破坏耐热，160℃2h～4h破坏毒性作用强，有选择毒害作用，引发特殊临床表现稍弱，各种细菌内毒素毒性作用大致相同。抗原性强，可刺激机体产生高效价抗毒素。经甲醛脱毒成为类毒素，仍有较强抗原性，可用于人工自动免疫刺激机体对多糖成份产生抗体，不形成抗毒素，不能经甲醛处理成为类毒素魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第13页疫苗现实状况梭菌类疫苗有单价苗和多联苗，单价疫苗在实际应用中难以取得很好效果，原因是致病梭菌种类较多，而且有是混合感染，单价苗往往是顾此失彼，不能有效地预防疾病。国外相继出现了包含产气荚膜梭菌四联、五联、七联和八联苗梭菌苗，不但把梭菌苗联合起来，而且还把所梭菌苗与需氧菌苗(如巴氏杆菌苗、沙门氏杆菌苗)联合起来，甚至与病毒苗(如羊痘疫苗)联合起来进行防疫。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第14页疫苗现实状况国内首先出现是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗，继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、快疫二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。文希喆等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎狙、肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、肠毒血症、黑疫和肉毒中毒六联苗。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第15页疫苗现实状况上世纪70年代到80年代，中监所文希喆、王泰健、屠伟英等科研人员，在国际上率先开创了梭菌多联干粉苗研究，取得满意效果，保留期长，使用方便，能够随意搭配，疫苗保护期也得到延长，基本克服了液体苗缺点。效力检验：多联苗所含成份越多，需要动物也越多，以致于到达不便检验程度，严重妨碍了多联苗发展，采取免疫动物测定血清中和效价方法，来评价梭菌苗效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后，用国际单位(I.U.)衡量血清中和效价，检验每批疫苗所需试验动物为8-12只。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第16页免疫效果与制苗菌液中毒素毒力正相关抗原含量过大会产生严重局部反应，会造成安全性检验不合格魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第17页主要毒素魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第18页α毒素各型产气荚膜梭菌均产生α毒素,它是产气荚膜梭菌最主要毒素之一,同时又是A型产气荚膜梭菌主要毒素是A型产气荚膜梭菌主要毒素。它含有磷脂酶C(PhospholipaseC,PLC)和鞘磷脂酶(Sphin-gomyelinase)两种酶活性,能水解细胞膜主要成份膜磷脂,从而破坏细胞膜结构完整性魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第19页理化性质和生物学特征α毒素是由370个氨基酸组成单链多肽,分子量为43ku。它是一个依赖于锌离子多功效性金属酶,含有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特征当把α毒素加热至60~70℃时,就能够使其失去活性,当深入加热到100℃时,又能够恢复部分活性魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第20页α毒素基因克隆与表示α毒素基因在禽类和哺乳动物中都是保守毒素开启子是最强开启子之一,可被大肠杆菌RNA聚合酶所识别,因而α毒素在本身开启子下不但可在产气荚膜梭菌本身中高效表示,也可在大肠杆菌中得到高效表示免疫α毒素C端功效区,来预防产气荚膜梭菌所致气性坏疽发生

刘家森等克隆了α毒素基因序列中从第294个碱基到中止密码子约900bp核苷酸序列,并表示出大小约3.8ku重组蛋白。重组蛋白完全涵盖了α毒素羧基末端蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对α毒素起主要作用Trp1、His11、Asp56、His68等氨基酸残基;表示重组蛋白含量占到菌体蛋白总量30%以上,且表现出良好反应原性,无毒性现象产生。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第21页β毒素产气荚膜梭菌β毒素是由产气荚膜梭菌B型和C型菌株产生坏死、致死性毒素,可引发人和动物坏死性肠炎,。β毒素对胰酶敏感，37℃作用30min后即完全失活β毒素分为β1、β2毒素,其中β2毒素是近年确认由C型产气荚膜梭菌产生一个新毒素。β2毒素与β1毒素没有显著氨基酸序列同源性,但含有相同生物学活性。而且,抗β2毒素抗体能识别纯化β2毒素,并能与β1毒素发生弱反应,然而,抗β1毒素抗体只能与β1毒素反应,却不能与β2毒素发生反应,表明二者免疫学相关性差,但其机制尚不清楚。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第22页β1毒素β1毒素是一个强毒素,含有细胞毒性、致死性。纯化β1毒素分子量为34ku左右,等电点(PI)约为5.6。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第23页β2毒素1997年Gibert等首先从来自仔猪坏死性肠炎病例培养上清中分离纯化到这种C型产气荚膜梭菌(CWC245)毒素β2毒素与家畜梭菌性胃肠道疾病相关β2毒素在猪胃肠道疾病中发挥了一定作用β2毒素基因存在于质粒上研究刚起步魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第24页ε毒素ε毒素是由B型和D型产气荚膜梭菌所产生，能引发家畜致死性肠毒血症,又称肉性肾病ε毒素编码基因etx位于质粒上,etx基因编码蛋白ε毒素前体在分泌早期是无毒性,经过蛋白酶去除毒素前体N端13个氨基酸和C端22个氨基酸后成为有活性成熟肽,成熟肽分子质量为32ku，参加活化蛋白酶包含产气荚膜梭菌产生λ蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、α胰凝乳蛋白酶。毒素是致死性毒素,给小鼠静脉注射纳克级ε毒素,在30min内即可引发小鼠死亡,而且其毒力仅次于肉毒素和破伤风毒素魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第25页ε毒素这种经过切除N、C末端两段序列且还有菌体本身蛋白参加活化过程较为少见。MiyataS等证实,去除C末端氨基酸残基是活化作用关键,而且不一样酶切产生毒素N、C末端及其活性也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化毒素毒力最强,而N末端氨基酸残基去除是否对毒素活性基本没有影响。惟有C末端切除位点对毒素活性,包含在神经突触膜上形成七聚体能力有影响。去除C末端氨基酸残基后成熟毒素其毒性是毒素前体1000倍。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第26页ε毒素ε毒素与宿主细胞表面作用机制还不是很清楚,不过现已证实它能够识别小鼠脑细胞和突触小体膜上唾液糖蛋白受体。当前只有两种细胞系对ε毒素敏感,分别为MDCK和人成平滑肌瘤G402细胞据推测这与这两种细胞表面存在有效结合毒素受体相关。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第27页ι毒素E型魏氏梭菌分泌组成：酶部分(Ia)和结合部分(Ib)功效：（1）Ia是一个ADP核糖转移酶;而Ib是一个细胞结合蛋白。（2）Ib与细胞膜受体结合后，马上进入细胞膜间隙，形成低聚体，继而与Ia结合，诱导细胞产生内吞作用。（3）Ib激活后能形成离子通道，而Ia则在pH值低于5.6时封闭这一通道。魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展第28页产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)

产生：A型魏氏梭菌在芽孢期产生，部分C、D型菌也可产生。影响原因：pH、温度和碳源功效（1）小肠上皮细胞顶部形成一个小孔，从而造成宿主体液和电解质流失。（2）提供紧