基因工程工具酶限制酶

基因工程工具酶限制酶基因工程工具酶限制酶第1页基因工程工具酶限制酶第2页一、限制性内切酶(restrictionenzyme)1．限制性核酸内切酶发觉

限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来。依据1994年美国出版《分子生物学百科全书》统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不一样微生物当中，分离出了2300种以上，可识别230种不一样DNA序列。早在本世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不一样菌株上平板培养效应研究为基础，发觉了原核生物体内存在着寄生控制限制(restriction)和修饰(modification)系统。基因工程工具酶限制酶第3页基因工程工具酶限制酶第4页

在限制修饰系统中限制作用是指一定类型细菌能够经过限制性酶作用，破坏入侵外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞入侵受到限制；

而生物细胞(如宿主)本身DNA分子合成后，经过修饰酶作用：在碱基中特定位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭本身限制性酶破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用含义。基因工程工具酶限制酶第5页2．核酸内切限制酶类型

特征I型II型III型限制和修饰活性单一多功效酶分开核酸内切酶和甲基化酶含有一个共同亚基双功效酶核酸内切限制酶蛋白质结构3种不一样亚基单一成份2种不一样亚基基因工程工具酶限制酶第6页切割位点在距寄主特异性位点最少1000bp地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近

距寄主特异性位点3，端24~26bp处甲基化作用位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化序列进行核酸内切酶切割能能能序列特异切割不是是是DNA克隆中用处无用十分有用用处不大基因工程工具酶限制酶第7页3．核酸内切限制酶命名法

因为发觉了大量限制酶，所以需要有一个统一命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议命名系统，已被广大学者所接收。他们提议命名标准包含以下几点：（1）用属名头一个字母和种名头两个字母，组成3个字母略语表示寄主菌物种名称。比如，大肠杆菌(Escherichia

coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示。基因工程工具酶限制酶第8页（2）用一个写在右下方标注字母代表菌株或型，比如Ecok。（3）假如一个特殊寄主菌株，含有几个不一样限制与修饰体系，则以罗马数字表示。所以，流感嗜血菌Rd菌株几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。基因工程工具酶限制酶第9页（4）全部限制酶，除了总名称核酸内切限制酶R外，还带有系统名称，比如核酸内切酶R．HindIII。一样地，修饰酶则在它系统名称之前加上甲基化酶M名称。对应于核酸内切酶R．HindIII流感嗜血菌Rd菌株修饰酶，命名为甲基化酶M.HindIII。

在实际应用上，这个命名体系已经作了深入简化：①因为附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行是把全部略语字母写成一行。②在上下文已经交待得十分清楚只包括限制酶地方，核酸内切酶名称R便被省去。基因工程工具酶限制酶第10页基因工程工具酶限制酶第11页4.Ⅱ型核酸限制性内切酶基础特征

它含有三个基础特征：

a.在DNA分子双链特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链断裂；

b.2个单链断裂部位在DNA分子上分布，通常不是彼此直接相正确；

c.

所以，断裂结果形成DNA片段，也往往含有互补单链延伸末端。基因工程工具酶限制酶第12页a.识别位点：

绝大多数II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成特定核苷酸序列。咱们称这么序列为核酸内切限制酶识别序列。

切割位点一个共同特点是，它们含有双重旋转对称结构形式，换言之，这些核苷酸正确次序是呈回文结构，比如：基因工程工具酶限制酶第13页

5'-CTGCAG-3,5'-CTGCAG-3,（a）PstI切割位点,

切割后形成3`—OH单链粘性末端，3'-GACGTC-5，3'-G+ACGTC-5，(b)EcoRI切割位点,切割后形成5`-P单链粘性末端，

5'-GAATTC-3’5'-G+AATTC-3’3'-CTTAAG-5’3'-CTTAAG-5’

（c）EcoRV切割位点,切割后形成平末端。5'-GATATC-3’5'-GAT+ATC-3’3'-CTATAG-5’3`-CTATAG-5`基因工程工具酶限制酶第14页b.

切割类型：

检验了非常大量试验事例之后发觉，由核酸内切限制酶作用所造成DNA分子切割类型，通常是属于下述两种独特排列方式之一：（1）两条链上断裂位置是交织地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式断裂结果形成含有粘性末端DNA片段；（2）两条链上断裂位置是处于一个对称结构中心，这么形式断裂是形成含有平末端DNA片段。基因工程工具酶限制酶第15页c.产生末端特征：

咱们所说粘性末端是指DNA分子在限制酶作用之下形成含有互补碱基单链延伸末端结构，它们能够经过互补碱基间配对而重新环化起来。

平末端DNA片段则不易于重新环化。基因工程工具酶限制酶第16页(2)同裂酶(isoschizomers)

有一些起源不一样限制酶识别是一样核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。

同裂酶产生一样切割，形成一样末端。比如，限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶，共同靶子序列是CCGG。基因工程工具酶限制酶第17页

与同裂酶对应一类限制性内切酶,它们即使起源不一样，识别靶序列也各不相同,但都能产生相同粘性末端,特称为同尾酶。常见BamHI,BclI,BglI,XhoI就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成粘性末端，很显然，由同尾酶所产生DNA片段，是能够经过其粘性末端之间互补作用而彼此连接起来，所以在基因克隆试验中很有用处。(3)同尾酶(isocaudamer)基因工程工具酶限制酶第18页

由一对同尾酶分别产生粘性末端共价结合形成位点，特称之为“杂种位点”(hybridsite)。但必须指出，这类杂种位点结构，普通是不再被原来任何一个同尾酶所识别。比如：SalI（5`-GTCGAC-3`）和XhoI(5`-CTCGAG-3`)消化片段相连，但所形成重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能被上述2种酶任一个酶识别和切割。但也有例外。基因工程工具酶限制酶第19页5．影响核酸内切限制酶活性原因(1)DNA纯度核酸内切限制酶消化DNA底物反应效率，在很大程度上是取决于所使用DNA本身纯度。污染在DNA制剂中一些物质，比如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶活性。基因工程工具酶限制酶第20页

为了提升核酸内切酶对低纯度DNA反应效率，普通采取以下三种方法：①增加核酸内切限制酶用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。②扩充酶催化反应体积，以使潜在抑制原因被对应地稀释。③延长酶催化反应保温时间。

在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备，会含有少许DNase污染。因为DNase活性需要有Mg2+存在，而在DNA贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，所以在这种制剂中DNA依然是稳定。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，DNA则会被DNase快速地降解掉。要防止发生这种情况，唯一方法就是使用高纯度DNA。

基因工程工具酶限制酶第21页(2)DNA甲基化程度

核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系组成个别，所以识别序列中特定核苷酸甲基化作用，便会强烈地影响酶活性。为防止产生这么问题，在基因克隆中使用是失去甲基化酶大肠杆菌菌株制备质粒DNA。

基因工程工具酶限制酶第22页(3)酶切消化反应温度

DNA消化反应温度，是影响核酸内切限制酶活性另一个主要原因。不一样核酸内切限制酶，含有不一样最适反应温度，而且彼此之间有相当大变动范围。大多数核酸内切限制酶标准反应温度都是37℃，但也有许多例外情况，它们要求37℃以外其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶最适反应温度低于标准37℃，比如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸内切限制酶最适反应温度则高于标准37℃，比如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；还有些核酸内切限制酶最适反应温度可高达60℃以上，消化反应温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶活性，甚至最终造成完全失活。基因工程工具酶限制酶第23页DNA分子结构

DNA分子不一样构型对核酸内切限制酶活性也有很大影响。一些核酸内切限制酶切割超螺旋质粒DNA或病毒DNA所需要酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高可达20倍。

另外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己处于不一样部位限制位点，其效率亦有显著差异。据推测，这很可能是因为侧翼序列核苷酸成份差造成。

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(5)核酸内切限制酶缓冲液

核酸内切酶标准缓冲液组份包含：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性正常发挥，是绝对地需要二价阳离子，通常是Mg2+。

对绝大多数限制酶来说，在pH=7．4条件下，其功效最正确。

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在“非最适”反应条件下(包含高浓度核酸内切限制酶、高浓度甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸内切限制酶识别序列特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外其它位点切割DNA分子。

有些核酸内切限制酶切割特异性，受所用缓冲液成份影响比较显著。比如，最常见EcoRI限制酶，在正常情况下，是在GAATTC识别序列处发生切割作用，但假如缓冲液中甘油浓度超出5％(V／V)，那么其识别序列特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶这种特殊识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。基因工程工具酶限制酶第26页6.

限制性内切酶反应终止

消化DNA样品后，在深入处理DNA样品前往往需要钝化内切酶活性，钝化大多数限制性内切酶方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ对热稳定，则需加入终止反应液(如加入0．5mol／LEDTA使之在溶液中终浓度到达10mmol/L)螯合Mg2+，以终止反应。另外，还能够用等体积酚抽提酶解产物，提取DNA。假如用限制性内切酶消化DNA分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。基因工程工具酶限制酶第27页7.利用限制酶对DNA进行消化详细步骤基因工程工具酶限制酶第28页限制酶消化反应进行以下是对0．2—1．0ugDNA进行消化经典反应步骤，如要对更大量DNA进行消化，则反应各个成份须对应放大。1)将DNA溶液加入一灭菌微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18ul。2)加入2ul适当10X限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。3)加入1—2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。

1单位酶通常定义为，在提议使用缓冲液及温度下，在20u1反应液中反应1小时，使lugDNA完全消化所需酶量。基因工程工具酶限制酶第29页4)将上述混合反应物置于适当温度并按所需时间进行温育。5)加入0．5mol／LEDTA(pH8．0)使终浓度达1