病毒感染的分子诊断

病毒感染的分子诊断病毒感染的分子诊断第1页病毒感染分子诊疗利用分子生物学方法对病毒进行检测分子生物学方法包含核酸扩增、核酸杂交、等温反应、质谱、普通测序、二代测序等检测对象主要是病毒核酸病毒感染的分子诊断第2页病毒感染核酸检测普通PCR、real-timePCR、巢式PCR、多重PCRFISH一代测序高通量测序病毒感染的分子诊断第3页PCRKaryB.MullisUSA美国教授KaryB.Mullis于1983年创造了PCR技术，他所以取得了1993年诺贝尔奖

病毒感染的分子诊断第4页PCR病毒感染的分子诊断第5页PCR优缺点及应用优点灵敏度高，特异性强操作简单设备要求低缺点PCR产物分析较繁琐，轻易出现人为判读错误只能进行定性检测，无法实现定量分析应用病毒判定联合测序用于病毒分型和病毒耐药突变位点分析病毒感染的分子诊断第6页Real-timePCR病毒感染的分子诊断第7页2023/8/28Real-timePCR病毒感染的分子诊断第8页Real-timePCR优缺点及应用优点灵敏度极高，特异性极强机器分析判读结果，降低人工判读失误可实现高通量检测缺点易出现污染，对人员操作要求高要求房间分区，对场地硬件条件要求较高不一样种属病毒之间没有相同核酸序列，各种病毒同时检测较难实现应用几乎应用于全部病毒感染检测，且在不一样国家地域应用最为广泛病毒感染的分子诊断第9页诺如病毒荧光探针法检测试剂盒全国首家获批诺如病毒核酸检测试剂盒病毒感染的分子诊断第10页诺如病毒核酸检测试剂盒（国械注准3400293）（核酸类我国空白）人鼻病毒核酸检测试剂盒（国械注准3400295）（我国空白）人博卡病毒核酸检测试剂盒（国械注准3400294）（国际空白）病毒感染的分子诊断第11页眼部病毒感染多重real-timePCR检测试剂盒一个反应管中可同时检测肠道病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒探针分别用FAM,HEX，CY3和CY5四种荧光标识探针有内参，构建好了标准品，可进行绝对定量加入了UNG酶，可有效控制污染检出限可达1-10copies\ml成本仅为市售试剂盒1/10效益成本比：TAKARA>Roche>Bio-Rad>Thermo病毒感染的分子诊断第12页Fluorescence

InSitu

Hybridization(FISH)CarloForestaetal.,PLOSONE,ClareConnor,Nature,HPV感染病毒感染的分子诊断第13页FISH优缺点及应用优点直接检测病变组织细胞标本，对疾病诊疗意义更大可检测病毒是否整合到人基因组缺点操作繁琐，对人员素质要求高需要单独细胞培养间应用HPV,EBV,登革热病毒，HIV病毒感染的分子诊断第14页基于转录扩增３种酶：逆转录酶、ＲＮＡ酶Ｈ和Ｔ７ＲＮＡ聚合酶２条尤其设计寡核苷酸引物恒温反应，不需要PCR仪能将病原体RNA扩增109倍，比常规PCR高２～３个数量级病毒感染的分子诊断第15页基于转录扩增优缺点及应用优点扩增时间短，恒温反应条件，不需要PCR仪在等温条件下，快速降解RNA可极大降低扩增过程中污染可能性缺点缺点是不能用于DNA病毒检测以及各种酶混合体系不稳定性应用在临床上应用于HCV、HIV、肠道病毒和呼吸道RNA病毒检测病毒感染的分子诊断第16页loop-mediatedisothermalamplification（LAMP）病毒感染的分子诊断第17页LAMP优缺点及应用优点等温扩增，不需PCR仪，可实现床旁或野外环境灵敏度和特异性均较高缺点引物设计极为复杂，研发门槛高，获批检测试剂盒少应用当前仅结核分枝杆菌取得CFDA认证，病毒检测尚处于研发阶段病毒感染的分子诊断第18页数字PCR病毒感染的分子诊断第19页数字PCR优缺点及应用优点无需标准品，可直接进行绝对定量对标本中抑制剂有较高耐受性为跨试验室比较提供绝对参考标准缺点样品分散技术稳定性有待提升，且成本较高通量较低，当前通常能检测信号为FAM和VIC应用当前仅用于科研，但在临床病毒检测和定量方面极具应用前景病毒感染的分子诊断第20页Sanger测序病毒感染的分子诊断第21页Sanger测序优缺点及应用优点能对病毒进行分型、突变分析为病毒传输路径等流行病学提供信息缺点通量低，一个反应体系只能分析一个病毒应用HBV、HCV、HIV、HSV、CMV、VZV、EBV、流感病毒等抗病毒药品适用性分析病毒感染的分子诊断第22页深度测序病毒感染的分子诊断第23页深度测序优缺点及应用优点不需要对标本中病毒有预期判断，能够发觉新发病毒感染通量高，可检测到标本中含量少病毒对于无菌体液中发觉病毒诊疗价值高缺点海量数据，分析有难度个别标本中发觉病毒不一定与疾病相关应用重症感染及新发突发传染病疫情，比如埃博拉病毒，寨卡病毒，H7N9均是经过深度测序被诊疗发觉病毒感染的分子诊断第24页法国梅里埃企业FilmArray®病原体全自动多重real-timePCR检测系统病毒感染的分子诊断第25页终点熔解曲线分析法国梅里埃企业FilmArray®病原体全自动多重real-timePCR技术原理病毒感染的分子诊断第26页FilmArray®呼吸道病原体检测组套美国FDA认证一个反应板能能同时检测呼吸道相关17种病毒和3种细菌仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂病毒：腺病毒冠状病毒229E冠状病毒HKU1冠状病毒OC43冠状病毒NL63人偏肺病毒人鼻病毒/肠道病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亚型甲型流感病毒H1-亚型甲型流感病毒H3亚型乙型流感病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒细菌：百日咳杆菌肺炎支原体肺炎衣原体病毒感染的分子诊断第27页FilmArray®腹泻病原体检测组套美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹泻相关5种病毒，6种细菌，6种致泻性大肠杆菌和4种寄生虫仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂细菌：弯曲杆菌艰难梭菌类志贺邻单胞菌沙门氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌弧菌病毒：腺病毒F40/F41亚型星状病毒诺如病毒GI/GII亚型轮状病毒札如病毒致泻性大肠杆菌：EAECEPECETECSTECO157EIEC寄生虫：隐孢子虫环孢子虫溶组织内阿米巴兰氏贾第鞭毛虫病毒感染的分子诊断第28页FilmArray®脑炎脑膜炎病原体检测组套美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹泻相关7种病毒，6种细菌，1种真菌仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂真菌：隐球菌/新型隐球菌病毒：巨细胞病毒肠道病毒单纯疱疹病毒1型单纯疱疹病毒2型人疱疹病毒6型人细小病毒水痘带状疱疹病毒细菌：大肠杆菌K1流感嗜血杆菌产单核细胞李斯特菌脑膜炎奈瑟氏菌无乳链球菌肺炎链球菌病毒感染的分子诊断第29页美国Luminex企业xTAG®

多重PCR微球探针检测系统20mins1hr2.5hrs45mins病毒感染的分子诊断第30页美国Luminex企业xTAG®

多重PCR微球探针检测技术原理病毒核酸提取病毒感染的分子诊断第31页美国Luminex企业xTAG®

多重PCR微球探针检测技术原理MultiplexRT-PCRusingtarget-specificTAGgedprimers&biotinylatedprimersGGCTACCGATTAG13’5’BBdsbiotinylated,TAGgedTS-PCRproductCCGATGGCTA3’TAG15’GGCTATAG1CCGAT3’TAG25’B5’TARGETPRESENTTARGETABSENT病毒核酸扩增病毒感染的分子诊断第32页TAGgedproductsarecapturedbytheircomplementaryAnti-TAGsequenceStreptavidin-phycoerythrinreporter(SA-PE)moleculeusedtodetectbiotinylatedprimerUniversalarraymadeupofdifferentbeadpopulationswithSA-PEreporterpresentAnti-TAG2TAG2Anti-TAG1BPERegion29SATAG1Region34美国Luminex企业xTAG®

多重PCR微球探针检测技术原理扩增病毒核酸与固定有特异性探针纳米微球杂交并检测病毒感染的分子诊断第33页美国Luminex企业xTAG®

多重PCR微球探针检测技术原理Luminex100/200xMAPTechnologybasedonflowcytometryRedLaser&APDs:classifyanti-TAGcoupledbeadsGreenLaser&PMT:quantifiesreporter,representingspecifichybridizationeventsMAGPIXxMAPTechnologyusingLEDsandCCDRedLED&CCDcamera:classifyanti-TAGcoupledbeadsGreenLED&CCDcamera:quantifiesreporter,representingspecifichybridizationeventsReadonLuminex

200™orMAGPIX

信号数据获取并分析病毒感染的分子诊断第34页美国FDA认证一个反应板能能同时检测呼吸道相关19种病毒，3种细菌需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断需要手工加样、扩增产物人工转移5小时出结果费用相对Flimarray较为经济细菌：肺炎衣原体肺炎衣原体军团菌病毒：腺病毒冠状病毒229E冠状病毒HKU1冠状病毒OC43冠状病毒NL63人博卡病毒人偏肺病毒人鼻病毒/肠道病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亚型甲型流感病毒H1-亚型甲型流感病毒H3亚型乙型流感病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒A型呼吸道合胞病毒B型xTAG®呼吸道病原体检测组套病毒感染的分子诊断第35页美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹泻相关3种病毒，6种细菌，3种致泻性大肠杆菌和3种寄生虫需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断需要手工加样、扩增产物人工转移5小时出结果费用相对Flimarray较为经济细菌：弯曲杆菌艰难梭菌志贺菌沙门氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌霍乱弧菌病毒：腺病毒F40/F41亚型诺如病毒GI/GII亚型轮状病毒A型致泻性大肠杆菌：ETECO157EIEC寄生虫：隐孢子虫溶组织内阿米巴兰氏贾第鞭毛虫xTAG®腹泻病原体检测组套病毒感染的分子诊断第36页美国赛沛企业Xpert®病原体全自动real-time检测系统1混合2加入3插入4检测病毒感染的分子诊断第37页美国赛沛企业Xpert®病原体全自动real-time检测技术原理高度集成化、自动化在一个反应杯里实现了标本病原体核酸提取、PCR、检测和数据分析病毒感染的分子诊断第38页Xpert®病原体检测项目美国FDA认证一个反应管仅能检测1-2种病原体仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作1-2小时出结果可检测病毒：甲型流感病毒\乙型流感病毒呼吸道合胞病毒肠道病毒HIV-1病毒载量定量HCV病毒载量定量诺如病毒人乳头瘤病毒埃博拉病毒可检测细菌：艰难梭菌MRSACRE病毒感染的分子诊断第39页美国GeneMark企业eSensor®探针-传感器分子检测系统多重RT-PCR之后用探针杂交再用伏安法电子传感器检测探针并分析信号病毒感染的分子诊断第40页eSensor®呼吸道病毒检测组套美国FDA认证能同时检测8种呼吸道病毒腺病毒：B,C和E组

冠状病毒：229E,HKU1,OC43和NL63型

甲型流感病毒：检测并分型

乙型流感病毒

人偏肺病毒副流感病毒：1,2,3和4型

呼吸道合胞病毒：A和B组

人鼻病毒需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断需要手工或机器提取核酸、扩增产物人工转移4-5小时出结果病毒感染的分子诊断第41页美国雅培企业Plex-id®

PCR-质谱串联分子检测系统多重RT-PCR利用电喷雾电离质谱分析产物病毒感染的分子诊断第42页美国FDA认证同时检测influenzaA和B

virus需要进行病原体核酸提取、多重PCR、质谱分析6-8小时出结果Plex-id®流感病毒检测试剂盒病毒感染的分子诊断第43页传染病长期有效防控能力提升和网络试验室连续竞争力增强十一五十二五十三五在“十一五”、“十二五”基础上，深入完善监测技术体系，大幅推进监测技术普及下沉，全方面提升病原发觉判定能力和新发传染病识别能力。最终提升对传染病暴发疫情监测预警敏感度和有效应对我国外重大传染病疫情处置能力。较为完善监测技术体系和质控管理体系较为丰富重大疫情监测实战经验较为高效检测技术平台运转和团体协作机制

国家科技重大专题牵头建设单位病毒感染的分子诊断第44页常规监测从30种扩充为98种全覆盖覆盖样本数15000份症候群检测病原体病毒细菌寄生虫发烧呼吸道（23种）11种12种

流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒、鼻病毒、MERS、H7N9、H5N1金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、A组乙型链球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、军团菌、结核分枝杆菌、卡他莫拉汉菌、鲍曼不动杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体腹泻（22种）5种13种3种轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒致泻性大肠埃希菌（内含5个种）、非伤寒沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气邻单胞菌、类志贺邻单胞菌、拟态弧菌、河弧菌阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫病发烧伴出疹（15种）9种6种

肠道病毒（EV71，CA16，CA10，CA6）、麻疹病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、人类小DNA病毒B19、EB病毒、人类疱疹病毒6型、埃博拉病毒伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、A组链球菌、炭疽、伯氏疏螺旋体、立克次体（内含多个种）发烧伴出血（11种）5种6种

汉坦病毒、登革病毒、新疆出血热病毒、新布尼亚病毒、埃博拉病毒鼠疫耶尔森菌、猪链球菌、钩端螺旋体、立克次体（内含多个种）、无形体（内含多个种）、埃立克体（内含多个种）脑炎脑膜炎（27种）10种8种9种寨卡、乙脑、腮腺炎、肠道病毒、单纯疱疹、脊髓灰质炎、麻疹、呼吸道合胞病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒脑膜炎奈瑟菌、b型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、B族链球菌、单增李斯特菌恶性疟原虫、弓形虫、带绦虫、新型隐球菌、肺吸虫、并殖吸虫、旋毛虫、广州管圆线虫、裂头蚴病毒感染的分子诊断第45页扩充病原体监测范围五大症候群扩充监测范围病原体病原体名称造成疾病EVD68发烧呼吸系统疾病双埃可病毒发烧呼吸系统疾病、腹泻、脑炎脑膜炎淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒病脑炎脑膜炎H10N8发烧呼吸系统疾病基孔肯亚病毒发烧伴出疹疾病尼帕病毒发烧呼吸系统疾病、脑炎脑膜炎墨累谷脑炎病毒脑炎脑膜炎病毒感染的分子诊断第46页病原体变异变迁研究综合利用三个五年计划数据，深度解析中部地域主要病原进化变异与疫情暴发和临床重症发病之间关系生物信息学分析方法体内体外评定技术环境因子分析对30种以上五大症候群传染病主要病原变异变迁特征进行深入研究分子时钟进化基因重组重配核苷酸变异速率阴阳性选择突变多肽极性分析蛋白结构模拟毒力抗原性组织细胞嗜性耐药性地域传输路径宿主传输链易感人群病毒感染的分子诊断第47页病原体变异变迁研究对主要病原重组株和变异株流行特征、抗原性、复制力和环境抵抗力等特征进行亲密跟踪，及时预警散发尤其是暴发疫