糖尿病治疗药物的研究进展

糖尿病治疗药物的研究进展

0糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱综合征糖尿病是一种以糖、脂肪和蛋白质为特征的代谢障碍综合征。2013年，世界成人糖尿病患者达到约3.82亿，预计到2035年达到5.92亿。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物和细胞小鼠为C57BL/6J小鼠(SPF级),购于解放军总医院医学实验中心,人脐带间充质干细胞提取自人新鲜脐带.1.1.2rt-pcr检测高脂饲料(D12492,美国);链脲佐菌素(STZ,sigma,美国);TrizolRNA提取试(Invitrogen,美国);PCR引物由华大基因合成;LC3B抗体、P62抗体、Bclin1抗体、Atg7抗体(Abcam,,美国);免疫荧光LC3B抗体(MBL,日本);P-AKT、PI3K抗体(美国CST公司)、β-tublin抗体、Westernblot二抗(中山金桥)、Q-PCR仪器(美国Bio-Rad公司)、激光共聚焦显微镜(Leica,德国).1.2实验方法1.2.1stz分次注射糖尿病模型40只体重约45g的雄性C57BL/6J小鼠采用高脂饲料喂养8w后,禁食约12h,腹腔注射STZ剂量为90mg/Kg,注射后连续监测血糖,血糖连续3d超过16.7mmol/L为造模成功.另15只同期正常饲料喂养小鼠为对照组,所有操作符合实验动物保护规范.1.2.2uc-mscs的输注人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定见参考文献[8].UC-MSC的输注:取生长至80%的融合第4代细胞,消化离心后用PBS重悬,调整细胞数目为5×101.2.3elisa检测肝脏活性UC-MSC输注后每天连续检测血糖,治疗7d后禁食12h经腹腔注射葡萄糖或胰岛素,进行葡萄糖耐量实验(IPGTT)或胰岛素耐量实验(IPITT),每间隔30min检测血糖至120min.采用ELISA检测空腹胰岛素(FINS)水平.稳态模型评估即胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹血糖(FPG,mmol/L)×空腹胰岛素(FINS)/22.5.实验结束后,用10%水合氯醛麻醉小鼠,开胸.血管夹夹住肝叶分支后取新鲜肝脏液氮冻存备用后,PBS经左心室快速灌流至主动脉,再以4%多聚甲醛灌流固定2h.取肝脏组织放入30%PB蔗糖中脱水过夜后用包埋剂包埋存于-80℃备用,部分组织进行HE染色和PAS染色.1.2.4辣根过氧化物酶标记/蛋白pcr检测取得各组新鲜冻存的肝脏后,提取其组织蛋白,取等量的细胞蛋白进行12%或10%SDS凝胶电泳,再转移至PVDF膜上,BSA封闭后,加入Atg7(1/10000)、Bclin-1(1/1000)、P62(1/10000)、LC3B(1/1000)、PI3K(1/1000)、p-AKT(1/1000)、AKT(1/1000)、GAPDH(1/2000)一抗,4℃孵育过夜.用TBST充分洗膜3次,并予以对应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h,曝光.使用ImageJ软件进行灰度分析.1.2.5免疫荧光检测肝脏细胞lc3b的发现按照前步骤包埋的各组肝脏组织以7μm厚度连续切片,进行LC3B免疫荧光染色.置于激光共聚焦显微镜下观察并采集图像.1.2.6mrt-pcr显示与肝脏炎症相关的因素mrnaTrizol法提取各组细胞的总RNA,逆转录合成cD-NA,选取β-actin作为内参照,利用21.2.7均数检验结果采用SPSS19.0软件进行分析,计量数据结果以±S表示,多组样本均数比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验.P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1uc-mscs输注后血糖,胰岛素及胰岛素敏感性检测UC-MSC治疗7d后,随机血糖和空腹血糖有明显下降(P<0.01,图1A-图1B),血胰岛素UC-MSC组有升高趋势但无统计学意义(P=0.3177,图1C).IPGTT和IPITT结果显示UC-MSC输注后糖耐量及胰岛素敏感性均较糖尿病组改善(P<0.01,图1D-1F).2.2uc-mscspi3k和p-akt/akt的染色检测UC-MSC输注后,Westernblot显示治疗组较糖尿病组肝脏胰岛素抵抗缓解(图2A),胰岛素抵抗相关通路(PI3K和p-AKT/AKT)在治疗后有明显的增强(P<0.05,图2B、2C).特殊染色HE染色显示糖尿病组存在广泛脂滴,经过UC-MSC治疗后肝脏中的脂滴明显减少(图2D).同样,PAS染色显示UC-MSC治疗后肝脏的糖原含量增加(图4E).2.3uc-msc在肝脏自噬相关蛋白mna和c-b、c-msc的变化Westernblot显示经UC-MSC治疗后肝脏的LC3B、Atg7有明显的增加,P62的表达降低(P<0.01,图3A、3C和3D),尤其反映自噬强度的LC3II/IRatio明显地增加(P<0.01,图3B).提示UC-MSC有增加肝脏自噬的能力.激光共聚焦显微镜观察到治疗后肝脏的LC3明显增强,尤其在肝脏血管周围的肝脏细胞(图3E)，在RNA水平，QPCR显示自噬相关蛋白的mRNA水平都有明显的上升（P<0.05，图F).3uc-msc输注对小鼠肝脏自噬的影响胰岛素抵抗是2型糖尿病的发展过程中一直存在的重要发病因素之一,尽管有多种药物有助于改善胰岛素抵抗,但始终有一定的局限性.因此需要寻找更加有效的解决办法.自噬是一种高度保守的自我降解过程,这一过程的目的是为了消除受损的细胞器和无用的长寿蛋白以维持细胞的内在平衡脐带间充质干细胞(UC-MSC)是一种具有多种分化潜能的成体干细胞,在先前的研究中发现MSC输注有改善2型糖尿病胰岛素抵抗的作用本研究利用2型糖尿病小鼠模型,使用UC-MSC输注治疗改善小鼠肝脏的胰岛素抵抗,增强其肝脏自噬.治疗后的小鼠在血糖,IPITT,IPGTT以及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)都有改善(P均<0.05).UC-MSC治疗有效改善了肝脏代谢,其中PI3K、P-AKT/AKT通路表达增强(P<0.05).HE染色和PAS染色能明显看出治疗的差异,肝脏脂滴明显减少,糖原含量增加.其原因与UC-MSC增强了肝脏自噬有关,治疗后其LC3B、Atg7的表达明显增加,值得注意的是测量自噬强度的重要指标LC3II/I极大提高(P<0.01),Atg7具有促进LC3I向LC3II转化的作用通过以上研究,发现UC-MSC输注可以增加2型糖尿病小鼠肝脏自噬,增强肝细胞PI3K、P-AKT/AKT通